Плазмидный вектор pBR322

При работе с клетками E.coli чаще всего используют плазмидный вектор pBR322. Этот вектор был сконструирован Боливаром и Родригесом в 80-тые годы прошлого века с помощью классических генетических методов (in vivo) и методов, применяемых при работе с рекомбинантными ДНК (in vitro). Наименование вектора, как и наименования всех векторов на основе плазмид, содержит латинскую букву “p” от aнглийского слова “plasmid”. Заглавные буквы “B” и “R” обозначают первые буквы фамилий создавших вектор исследователей: Bolivar и Rodriguez., а число 322 - цифровое обозначение, взятое из их исследовательских протоколов. pBR322 имеет многие свойства идеального плазмидного вектора для клонирования ДНК (рис. 18).

Рис. 18. Плазмидный вектор pBR322.

Показаны уникальные сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции; участки ДНК, обеспечивающие устойчивость к ампициллину (amp^r) и тетрациклину (tet^r) а также участок инициации репликации (ori).

Установлена полная нуклеотидная последовательность этого вектора длиной 4361 п.н. Наличие в ее структуре участка инициации репликации (ori) от природной плазмиды кишечной палочки colE1 обеспечивает репликацию исключительно в E.coli и. дает возможность получить плазмидную ДНК с высоким выходом (10-20 копий на клетку). Нуклеотидные последовательности pBR322 содержат уникальные участки узнавания для эндонуклеаз рестрикции, что дает возможность получения линейных молекул плазмиды с разнообразными липкими концами. Кроме того, этот вектор содержит два селективных маркера: гены устойчивости к ампициллину (amp^r) и тетрациклину (tet^r).

Клетки E.coli, содержащие pBR322, выращивают на питательных средах c ампициллином или тетрациклином, либо с обоими антибиотиками. Если встроить какой-либо фрагмент ДНК по рестрикционному сайту, расположенному в одном из маркерных генов, то этот ген инактивируется (рис. 19).

Рис. 19. Фенотипические свойства клеток, содержащих плазмиду pBR322 со вставками и без них.

Так, при встраивании ДНК, например по сайту для эндонуклеазы рестрикции PstI, расположенному на участке, кодирующем устойчивость к ампициллину, не может синтезироваться белок, обеспечивающий рост клеток, содержащих такую рекомбинантную ДНК, на средах с ампициллином. Такие клетки способны расти на средах, содержащих тетрациклин, но не ампициллин. И наоборот, вставки сегментов ДНК по участкам узнавания ферментов, расположенных в гене устойчивости к тетрациклину, например HindIII или BamHI, оставляют возможность выживания клеток только на средах с ампицллином. При любой локализации вставки в молекуле вектора происходит отбор только тех бактериальных колоний, которые содержат рекомбинантные плазмидные ДНК.

.

Дата добавления: 2015-11-16