|
Читайте также: |
Б И О Т Е Х Н О Л О Г И Я
Часть I
ТЕХНОЛОГИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК
Учебное пособие
Печатается по решению кафедры зоологии Российского государственного педагогического университета имени А.И.Герцена
Цымбаленко Н.В. Биотехнология.Ч.1. Технология рекомбинантной ДНК: учебное пособие (для студентов биологических специальностей педагогических университетов), 2011 г.
Материал, представленный в данном учебном пособии, позволит обеспечить студентам биологических специальностей педагогических ВУЗов знакомство с современными методами технологии создания и применения рекомбинантных ДНК для фундаментальных и прикладных целей, а также поможет понять основные молекулярные принципы,на которых базируется биотехнология.
Объем и глубина излагаемого в пособии материала определяется учебными курсами по биотехнологии, которые с 2005 года автор пособия читает студентам факультета биологии РГПУ им А.И. Герцена.
Рецензенты:
Атаев Г.Л., заведующий кафедрой зоологии факультета биологии Российского государственного педагогического университета имени А.И.Герцена, доктор биологических наук, профессор (РГПУ)
Кириллова Н.В., заведующий кафедрой биохимии Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии, доктор биологических наук, профессор
СОДЕРЖАНИЕ
| Введение | ||
| Ферменты – инструменты генетической инженерии | ||
| . | Эндонуклеазы рестрикции Номенклатура Ферментативная активность компонентов системы рестрикции-модификации Липкие концы Тупые концы Классификация эндонуклеаз рестрикции Эндонуклеазы рестрикции типа II Физическое картирование ДНК по участкам узнавания эндонуклеаз рестрикции | |
| Фосфомоноэстеразы | ||
| Полинуклеотидкиназа | ||
| Лигазы | ||
| Полимеразы | ||
| ДНК-полимераза | ||
| Обратная транскриптаза | ||
| Терминальная трансфераза, поли-А - полимераза | ||
| 2. | Способы объединения фрагментов ДНК | |
| Лигирование по одноименным "липким" концам | ||
| Лигирование по одноименным "липким" концам с обработкой щелочной фосфатазой | ||
| Лигирование по "тупым" концам | ||
| Лигирование фрагментов с разноименными липкими, или липким и тупым концами | ||
| 3. | Генетические векторы для клонирования ДНК | |
| Вставки ДНК | ||
| Векторы для клонирования ДНК | ||
| Плазмидные векторы Плазмидный вектор pBR322 Введение рекомбинантной ДНК в клетки бактерий и отбор трансформантов Другие плазмидные векторы | ||
| Векторы на основе бактериофага λ | ||
| Гибридные векторы | ||
| Векторные системы для клонирования очень крупных фрагментов ДНК | ||
| BAC-система | ||
| YAC-векторы | ||
| 4. | Вспомогательные методы технологии рекомбинантной ДНК | |
| Химический синтез ДНК | ||
| Секвенирование ДНК | ||
| Молекулярная гибридизация Гибридизация нуклиновых кислот в растворе Гибридизация нуклиновых кислот на твердых подложках Гибридизация на чипах | ||
| Полимеразная цепная реакция Метод ПЦР ПЦР в реальном времени Обратная транскрипция, сопряженная с полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР) | ||
| Направленный мутагенез | ||
| 5. | Библиотеки генов | |
| Создание геномных библиотек. Скрининг с помощью ДНК-ДНК-гибридизации. Иммунологический скрининг. Скрининг по активности белка Клонирование структурных генов эукариот. | ||
| 6. | Системы экспрессии чужеродных генов | |
| Экспрессия генов в клетках прокариот в составе плазмид | ||
| Экспрессия генов, интегрированных в хромосомную ДНК прокариот | ||
| Экспрессия рекомбинантных генов в эукариотических системах | ||
| Экспрессирующие векторы для работы с клетками млекопитающих (ЭВМ) | ||
| 7. | Химерные белки | |
| Репортерные гены | ||
| Другие области применения “химерных белков” | ||
| Повышение эффективности секреции | ||
| 8. | Словарь терминов | |
| 9. | Список используемой литературы | |
ВВЕДЕНИЕ
Технология рекомбинантной ДНК (ее называют также молекулярным клонированием или генной инженерией) — это совокупность экспериментальных процедур, позволяющая осуществлять перенос генетического материала (дезоксирибонуклеиновой кислоты, ДНК) из одного организма в другой (Глик Б. и Пастернак Дж). Другими словами – это получение новых комбинаций генетического материала путем проводимых вне клетки манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот и переноса созданных конструкций генов в живой организм, в результате которого достигается их включение и активность в этом организме и у его потомства. Речь идет о направленном, по заранее заданной программе конструировании молекулярных генетических систем вне организма с последующим введением их в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата рецепиентного организма и сообщают ему новые уникальные генетические, биохимические, а затем и физиологические свойства.
Генная инженерия появилась благодаря работам многих исследователей в разных отраслях биохимии и молекулярной генетики. На протяжении многих лет главным классом макромолекул считали белки. Существовало даже предположение, что гены имеют белковую природу. Лишь в 1944 году Эйвери, Мак Леод и Мак Карти показали, что носителем наследственной информации является ДНК. С этого времени начинается интенсивное изучение нуклеиновых кислот. Спустя десятилетие, в 1953 году Дж. Уотсон и Ф. Крик, основываясь на многочисленном фактическом материале по химии нуклеиновых кислот и рентгеноструктурному анализу ДНК, создали двуспиральную модель структуры ДНК. Именно этот год принято считать годом рождения молекулярной биологии.
На рубеже 50 - 60-х годов были выяснены свойства генетического кода, а к концу 60-х годов его универсальность была подтверждена экспериментально. Шло интенсивное развитие молекулярной генетики, объектами которой стали E. coli, ее вирусы (бактериофаги) и плазмиды. Были разработаны методы выделения высокоочищенных препаратов неповрежденных молекул ДНК, плазмид и вирусов. ДНК вирусов и плазмид вводили в клетки в биологически активной форме, обеспечивая ее репликацию и экспрессию соответствующих генов. В 70-х годах был открыт ряд ферментов, катализирующих реакции превращения ДНК. Таким образом, предпосылками к созданию технологии рекомбинантных ДНК послужили многие открытия в области молекулярной биологии, энзимологии нуклеиновых кислот и молекулярной генетики бактериальных вирусов и внехромосомных элементов бактерий (плазмид). Конструирование рекомбинантных молекул осуществляется с помощью целого арсенала ферментов — обязательного и незаменимого инструмента практически всех этапов этого сложнейшего процесса. Особая роль в развитии методов генной инженерии принадлежит рестрицирующим эндонуклеазам и ДНК-лигазам.
Технология рекомбинантной ДНК является важной составной частью биотехнологии. Поэтому ее часто называют молекулярной биотехнологией. Родившись в начале 70-х годов, она добилась сегодня больших успехов. Методы молекулярной биотехнологии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих в "фабрики" для масштабного производства любого белка. Это дает возможность детально анализировать структуру и функции белков и использовать их в качестве лекарственных средств. В качестве примера можно привести биотехнологическое производство соматотропина.
Соматотропин - гормон роста человека, секретируемый гипофизом. Недостаток этого гормона приводит к гипофизарной карликовости. Если вводить соматотропин в дозах 10 мг на кг веса три раза в неделю, то за год ребенок, страдающий от его недостатка, может подрасти на 6 см. Ранее его получали из трупного материала, из одного трупа: 4 - 6 мг соматотропина в пересчете на конечный фармацевтический препарат. Таким образом, доступные количества гормона были ограничены, кроме того, гормон, получаемый этим способом, был неоднороден и мог содержать медленно развивающиеся вирусы. Компания "Genentec" (США) в 1980 году разработала технологию производства соматотропина с помощью бактерий, который был лишен перечисленных недостатков. В 1982 году гормон роста человека был получен в культуре E. coli и животных клеток в институте Пастера во Франции.
В 1978 году исследователи из компании "Genentec" впервые получили в специально сконструированном штамме кишечной палочки другой гормон – инсулин, а с 1984 года было начато промышленное производство этого необходимого медицинского препарата и в СССР. При производстве интерферона используют как E. coli, S. cerevisae (дрожжи), так и культуру фибробластов или трансформированных лейкоцитов. Аналогичными методами получают также безопасные и дешевые вакцины.
На технологии рекомбинантных ДНК основано получение высокоспецифичных ДНК-зондов, с помощью которых изучают экспрессию генов в тканях, локализацию генов в хромосомах, выявляют гены, обладающие родственными функциями у разных организмов. ДНК-зонды также используют в диагностике различных заболеваний.
Технология рекомбинантных ДНК сделала возможным нетрадиционный подход "белок-ген", получивший название "обратная генетика". При таком подходе из клетки выделяют белок, клонируют ген этого белка, модифицируют его, создавая мутантный ген, кодирующий измененную форму белка. Полученный ген вводят в клетку. Если он экспрессируется, несущая его клетка и ее потомки будут синтезировать измененный белок. Таким образом, открывается возможность “исправлять” дефектные гены и лечить наследственные заболевания.
Если гибридную ДНК ввести в оплодотворенное яйцеклетку, могут быть получены трансгенные организмы, экспрессирующие мутантный ген и передающие его потомкам. Генетическая трансформация животных позволяет установить роль отдельных генов и их белковых продуктов как в регуляции активности других генов, так и при различных патологических процессах. С помощью генетической инженерии созданы линии животных, устойчивых к вирусным заболеваниям, а также породы животных с полезными для человека признаками. Например, микроинъекция рекомбинантной ДНК, содержавшей ген соматотропина быка, в зиготу кролика позволила получить трансгенное животное с гиперпродукцией этого гормона. Полученные животные обладали ярко выраженной акромегалией.
В настоящее время даже трудно предсказать все возможности, которые будут реализованы в ближайшие несколько десятков лет.
Цель прикладной генетической инженерии заключается в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека. Например, получение “биологических реакторов” - микроорганизмов, растений и животных, продуцирующих фармакологически значимые для человека вещества, создание сортов растений и пород животных с определёнными ценными для человека признаками. Методы генной инженерии позволяют провести генетическую паспортизацию, диагностировать генетические заболевания, создавать ДНК-вакцины, проводить генотерапию различных заболеваний.
Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:
Однако, никакого единого, универсального набора методик здесь не существует, но чаще всего эксперименты с рекомбинантной ДНК проводят по следующей схеме:
· из организма — донора нужных генов — экстрагируют нативную ДНК (клонируемая ДНК, встраиваемая ДНК, ДНК-мишень, чужеродная ДНК), подвергают ее ферментативному гидролизу (расщепляют, разрезают) и соединяют (лигируют, сшивают) с другой ДНК (вектор для клонирования, клонирующий вектор) с образованием новой, рекомбинантной молекулы (конструкция “клонирующий вектор—встроенная ДНК” );
· э ту конструкцию вводят в клетку-хозяина (реципиент), где она реплицируется и передается потомкам. Этот процесс называется трансформацией;
· идентифицируют и отбирают клетки, несущие рекомбинантную ДНК (трансформированные клетки);
· получают специфический белковый продукт, синтезированный клетками-хозяевами, что служит подтверждением клонирования искомого гена.
.
Дата добавления: 2015-11-16; просмотров: 155 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая страница | | | следующая страница ==> |
| Бодо Шефер. Мани, или азбука денег 10 страница | | | Эндонуклеазы рестрикции |