Читайте также:
|
Определение активности аминотрансфераз.
Аспартатаминотансфераза (АсАТ) и аланинаминотрансфераза (АлАТ) – близкие по действию ферменты, при участии которых в организме человека осуществляется межмолекулярный перенос аминогрупп с аминокислот на кетокислоты. Этот процесс называется переаминированием. Значение переаминирования состоит в синтезе и разрушении отдельных аминокислот в организме.
Аминотрансферазы (АсАТ и АлАТ) являются внутриклеточными ферментами и их содержание в сыворотке крови здоровых людей невелико. Однако при повреждении или разрушении клеток, содержащих АсАТ и АлАТ (клеток печени, мышц сердца, скелетной мускулатуры и почек) происходит дополнительный выброс этих ферментов в кровяное русло, что приводит к повышению их активности в крови.
Максимальное количество АлАТ содержится в печени. При поражении клеток печени вирусами, различными химическими веществами, в т.ч. алкоголем и лекарствами, а также при нарушении оттока желчи из-за сдавливания желчного протока или его закупорке камнями активность АлАТ в крови возрастает. Поэтому определение активности фермента в сыворотке крови широко используется для диагностики болезней печени. Степень увеличения активности АлАТ, как правило, пропорциональна тяжести заболевания, в острых случаях активность фермента в сыворотке крови может превышать нормальные значения в 5-10 раз. При инфекционном гепатите повышение активности фермента происходит в очень ранние сроки. С увеличением сроков заболевания активность фермента обычно снижается, но медленно, в течение нескольких месяцев – при легком течении заболевания. Резкое увеличение активности АлАТ наблюдается и при безжелтушной форме заболевания, поэтому данный тест широко применяется при обследовании лиц, пребывающих в очаге инфекции. Исследование активности АлАТ обязательно для всех доноров крови для исключения хронических заболеваний печени.
Длительно продолжающееся увеличение активности трансаминаз или повышение в поздние сроки заболевания может означать развитие массивного развитие некроза печени. Высокая активность АсАТ, превышающая активность АлАТ, предполагает обширный некроз и плохой прогноз (это происходит за счет митохондриальной АсАТ).
При рецидивах и обострении активность фермента вновь повышается. Активность АсАТ при этом также повышается, но значительно ниже, чем АлАТ. Коэффициент АсАТ/АлАТ < 1. Умеренное повышение активности фермента наблюдается при циррозе печени, хроническом гепатите. Таким образом, определение активности АлАТ имеет значение:
· Для обследования контактных в очаге инфекции;
· Как индикатор остроты и активности патологического процесса в печени;
· Для диагностики и дифференциальной диагностики заболеваний
печени;
· Критерий полноты выздоровления.
Повышение активности аминотрансфераз можно отметить и у здоровых людей, находящихся на диете, богатой белком или содержащей до 30 % сахарозы.
AсАT в большом количестве находится в клетках сердца и печени. При инфаркте миокарда увеличение активности AсАT в крови наблюдается через 6-8 часов с момента приступа, а спустя 24-36 часов она возрастает в 4-5 раз относительно верхнего предельного уровня диапазона нормальных значений. Снижение активности AсАT до нормальных значений происходит лишь через 3-7 суток. Следует отметить, что повышение активности AсАT в крови наблюдается при формах инфаркта миокарда, которые электрокардиографически выявить невозможно. Сердечная мышца содержит незначительное количество АлАТ. Поэтому уровень активности АлАТ в сыворотке крови при инфаркте миокарда обычно остается в пределах нормы.
Повышение активности AсАT в крови (также как АлАТ) происходит при многих заболеваниях печени. Однако соотношение между увеличением активностей AсАT и АлАТ при разных заболеваниях отличается, поэтому их параллельный анализ дает дополнительную информацию, используемую для постановки точного диагноза.
Снижение активности AсАT и AлАT ниже нормы встречается только при тяжёлых поражениях печени, когда значительно уменьшается количество клеток, синтезирующих эти ферменты (обширный некроз, цирроз).
Существующие методы определения активности аминотрансфераз в сыворотке крови можно разделить на две основные группы:
1. колориметрические (с остановкой реакции) и метод конечной точки
2. кинетические.
Колориметрический метод Райтмана-Френкеля (основан на образовании пируват-2,4-динитрофенилгидразона), несмотря на присущие ему недостатки, продолжает оставаться распространённым в клинико-диагностической практике. К основным недостаткам данного метода можно отнести:
1. невозможность контроля линейности реакции;
2. накопление в реакции оксалоацетата, ингибирующего аминотрансферазы;
3. необходимость построения калибровочного графика;
4. резкое увеличение адсорбции при высокой активности ферментов, затрудняющее учёт результатов;
5. длительность исполнения анализа и некоторые другие.
Принцип метода:
В результате переаминирования, происходящего под действием АлАТ и АсАТ, образуются ПВК и ЩУК. ЩУК способна в процессе ферментативной реакции превращаться в ПВК. При добавлении 2,4 динитрофенилгидрозина образуется гидразон ПВК. Гидразон ПВК в щелочной среде дает окрашивание, интенсивность которого пропорциональна количеству образовавшейся ПВК.
Норма:
АлАТ – 0-40 Е/л (0,1 - 0,68 ммоль ПВК \л.ч)
АсАТ – 0-37 Е/л (0,1 - 0,45 ммоль ПВК \ л.ч)
Кинетические методы. Преимущество кинетического метода состоит в возможности прямого непрерывного спектрофотометрического измерения скорости ферментативной реакции в начальной линейной части кинетической кривой; оксалоацетат удаляется по мере его образования; для расчёта активности ферментов не требуется построения калибровочного графика. Этот современный метод является высокоспецифичным, быстрым и позволяет получать более точные результаты. Во многих странах он является стандартным, референтным способом определения AсАT и АлАТ.
В основе кинетического метода определения активности аминотрансфераз лежит оптический тест Варбурга. Принцип теста основан на разнице поглощения при длине волны 340 нм восстановленной (НАДН) и окисленной (НАД) форм никотинамидаде-ниндинуклеотида. При 340 нм НАДН имеет максимальную адсорбцию, тогда как НАД при данной длине волны не имеет поглощения.
Для определения активностей аминотрансфераз используют сопряженные ферментативные реакции: основная - реакция переаминирования, катализируемая AсАT или АлАТ, и индикаторная - реакция, протекающая под воздействием вспомогательных, индикаторных ферментов, малатдегидрогеназы (МДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ).
Схема определения активности AсАT:
1. Основная реакция:
АсАТ
L-аспартат + α-кетоглутарат оксалоацетат + L-глутамат
2. Индикаторная реакция
МДГ
оксалоацетат + НАДН L-малат + НАД
Схема определения активности АлАТ:
1. Основная реакция
АлАТ
L-аланин + α-кетоглутарат пируват + L-глутамат
2. Индикаторная реакция
ЛДГ
пируват + НАДН L-малат + НАД
В результате окисления НАДН происходит уменьшение оптической плотности при длине волны 340 нм. Снижение оптической плотности отражает активность AсАT и АлАТ. Для расчета активности ферментов используется коэффициент молярной экстинкции НАДН.
Определение активности фосфатаз.
Фосфатазы - это ферменты, отщепляющие остаток фосфорной кислоты от ее органических эфирных соединений. Они участвуют в минеральном (фосфорно-кальциевом) обмене. Не рекомендуется использовать при определении активности ЩФ фтористые соединения и оксалат, ингибирующие фермент.
В зависимости от рН, при котором проявляется их наибольшая ферментативная активность, различают кислую и щелочную фосфатазу.
Щелочная фосфатаза (ЩФ) гидролизует разные синтетические субстраты при оптимуме рН 10,0. Это металлопротеид, в состав активного центра которого входит цинк. ЩФ содержится в различных органах и тканях, особенно много ее обнаруживается в растущих костях (фермент содержится в мембранах остеокластов), желчи и плаценте. Этот фермент служит биохимическим маркером фосфорно-кальциевого обмена в костной ткани, скрининговым тестом остеопороза.
Кислая фосфатаза проявляет оптимальное действие при рН=4,6. Наиболее богатым источником этого лизосомального фермента является предстательная железа, фосфатазная активность которой приблизительно в 1000 раз превышает активность этого фермента костной ткани, печени и других органах.
Методы исследования фосфатаз отличаются по используемому субстрату.
В настоящее время в клинико-лабораторной практике применяются 2 основные группы методов определения активности ЩФ:
1. Колориметрические - с измерением в конечной точке;
2. Кинетические.
Использование в качестве субстрата пара-нитрофенилфосфата позволяет осуществить оба варианта.
Принцип метода:
Субстрат пара-нитрофенилфосфат натрия подвергается ферментативному расщеплению с образованием пара- нитрофенола, дающего в щелочной среде желтое окрашивание.
Норма ЩФ – 0-117 Е/л (1 - 3 ммоль пара-нитрофенола \ л.ч)
Клинико-диагностическое значение.
Повышение активности ЩФ происходит главным образом при двух видах патологии: костных заболеваниях, связанных с пролиферацией остеобластов, и болезнях, сопровождающихся явлениями холестаза. Исследование активности ЩФ приобрело особенное значение у детей, так как ее активность повышается при рахите, причем еще до появления клинических симптомов заболевания и до снижения неорганического фосфора в крови.
Активность ЩФ увеличена на протяжении всего периода болезни и выравнивается после затихания клинических симптомов рахита. Путем определения активности ЩФ удается выявить скрытые формы рахита, а при систематическом обследовании детей и предрахитические стадии заболевания. Повышение активности ЩФ в данном случае надо рассматривать как компенсаторный механизм обеспечения потребностей организма в неорганических фосфатах. Повышение активности ЩФ встречается при заболеваниях костей, связанных с увеличением количества остеобластов, а также сопровождающихся распадом костной ткани: гипертиреоидизме, болезни Педжета (деформирующий остит), карциноме костной ткани остеосаркоме и других заболеваниях.
Повышение активности ЩФ характерно для заболеваний печени и желчных путей. Резкое увеличение отмечается при внепеченочном холестазе. При обтурационной желтухе, возникшей вследствие закупорки внепеченочных желчных протоков при камнях желчного пузыря, а также при новообразованиях в этих органах активность ЩФ повышается до 10 раз и более.
Внутрипеченочный холестаз при гепатитах, циррозе печени также сопровождается повышением ЩФ, но степень гиперферментемии значительно ниже (до 2-3 раз).
Снижение активности ЩФ возникает при ослаблении остеобластических процессов, например, при замедленном росте у детей.
Активность ЩФ уменьшается при гипотиреозе, авитаминозе С, старческом остеопорозе и т.д.
Кровь на исследование берется у пациента после голодания. Сыворотку перед определением активности щелочной фосфатазы можно хранить в холодильнике не более 48 часов, однако при этом значения активности ЩФ могут слегка понижаться (до 10%). В размороженной сыворотке активность фермента падает.
Повышение активности кислой фосфатазы (КФ), в большом количестве содержащейся в предстательной железе, при нормальном уровне ЩФ указывает на новообразование в этой железе. Возрастание активности КФ наблюдается через 1-2 сутки после оперативного вмешательства на железе, а также при ее биопсии. Не рекомендуется брать кровь для анализа активности кислой фосфатазы в течение 24 часов после массажа простаты или ее инструментального исследования. Лихорадочное состояние способно обусловить ложно завышенные результаты активности фермента.
Биологическим материалом для исследования кислой фосфатазы служит сыворотка крови. Венозную кровь следует как можно быстрее доставить в лабораторию. Пробу крови охлаждают до 4-8°С; сыворотку отделяют от сгустка (фермент присутствует в тромбоцитах и высвобождается при их активации); отбирают 1 мл сыворотки и вносят в пробирку, содержащую гидросульфат натрия (NaHSC).
Исследование активности гамма-глутамилтрансферазы.
Гамма-глутамилтрансфераза (ГГТ) или гамма- глутамилтранспептидаза – это преимущественно мембраносвязанный гликопротеид, катализирующий перенос аминокислот через клеточную мембрану и другие процессы. Фермент содержится в лизосомах, мембранах и цитоплазме клеток. Среди биологических жидкостей наиболее высокая активность ГГТ наблюдается в желчи. Методы определения активности ГГТ различаются по используемому субстрату. Наиболее часто в последнее время для методов конечной точки и кинетического методов используется определение образовавшегося 4-нитроанилина.
Принцип метода:
Субстрат под действием ГГТ расщепляется с образованием 4-нитроанилина, который определяют фотометрически после остановки реакции подкислением.
Норма: 7-50 Е/л (мужчины - 0,9-6,36 ммоль \ ч.л, женщины - 0,6-3,96 ммоль\ ч.л)
Клинико-диагностическое значение.
Определение активности ГГТ в сыворотке крови приобрело большое значение для диагностики заболеваний печени и гепатобилиарного тракта. У всех больных с механической желтухой найдена увеличенная до 15-140 раз выше нормы активность ГГТ.
При гепатите активность ГГТ превосходит показатели нормы обычно в 5-6 раз и возрастание активности обычно происходит с момента падения активности трансаминаз. У практически выздоровевших после гепатита активность ГГТ находится в пределах нормы. При хроническом гепатите, циррозе печени активность фермента почти всегда увеличена, с наступлением декомпенсации она снижается (на фоне увеличения активности трансаминаз и билирубина). Понижение активности фермента служит надежным прогностическим признаком декомпенсации.
У онкологических больных с метастазами в печень установлено весьма значительное повышение активности фермента: до 12 и более раз выше верхней границы нормы.
При остром панкреатите активность ГГТ всегда увеличена до 25 раз выше верхней границы нормы.
При инфаркте миокарда повышение активности ГГТ начинается с 4-х суток и достигает максимума через 2-3 недели, а затем, в большинстве случаев, постепенно приходит в норму. Возрастание активности фермента отражает течение репаративных процессов в миокарде и расценивается как общий ответ организма на развивающееся патологическое состояние.
Высокая активность отмечена в крови больных, страдающих алкоголизмом. Это чувствительный тест на выявление алкогольной интоксикации и может использоваться для диагностики хронического алкоголизма.
Определение активности альфа-амилазы.
Альфа-амилаза (диастаза) – это фермент, осуществляющий гидролитическое расщепление полисахаридов до декстринов, мальтозы и глюкозы. Конечные продукты действия амилазы не дают цветной реакции с йодом. Наиболее богаты амилазой поджелудочная и слюнные железы. Амилаза секретируется в кровь, главным образом, из этих органов.
Плазма крови человека содержит преимущественно амилазу двух типов: панкреатическую и слюнную, третий тип амилазы – крупная или макроамилаза. С мочой выделяется, в основном, панкреатическая амилаза, что является одной из причин, почему определение амилазы в моче более информативно, чем в крови для оценки функционального состояния поджелудочной железы. Считают, что 65% амилазной активности мочи обусловлено панкреатической амилазой, в то время, как 60% амилолитической активности сыворотки обеспечивается амилазой слюнных желез. При остром панкреатите панкреатическая амилаза увеличивается в сыворотке до 89%, а в моче до 92% без изменения показателей амилазы слюнных желез.
Активность амилазы в крови и моче подвергается значительным изменениям в течение дня, а также отмечены индивидуальные различия. Колебания активности амилазы вызывают необходимость ее исследования в суточной моче для оценки функции поджелудочной железы.
Существующие методы определения активности α-амилазы делятся на 2 группы:
1. Метод конечной точки – основан на определении остатка нерасщепленного крахмала по степени интенсивности его реакции с йодом (метод Каравея).
2. Метод кинетический.
Нормальные значения:
α-амилаза сыворотки крови – 0-80 Е/л (16-30 г/ч*л)
α-амилаза мочи – 28-160 г/ч*л
Примечания:
1. Сыворотка крови не должна быть гемолизирована.
2. Условия проведения опыта имеют большое значение, в частности точное время инкубации 5 минут, поэтому не рекомендуется проводить одновременное исследование более 5 сывороток.
3. Определение активности α-амилазы в моче проводится аналогично определению в крови, однако при гиперамилазурии рекомендуется разводить мочу с последующим пересчетом.
4. На активность α-амилазы влияют лекарственные препараты – антибиотики, обезболивающие, а также алкоголь.
Клинико-диагностическое значение.
Повышение активности амилазы, главным образом, встречается при заболеваниях поджелудочной железы.
При остром панкреатите активности фермента в крови и моче увеличивается более чем в 10 раз. Гиперамилаземия наступает непосредственно после начала заболевания, достигает максимума к 12-24 часам, после чего активность фермента быстро снижается и приходит к норме на 2-6 день. Обычно, гипрамилазурия длится дольше, чем увеличение активности фермента в сыворотке, поэтому на 2-3 день после болевого приступа более информативно определять активность α-амилазы в моче.
При хроническом панкреатите, раке поджелудочной железы повышение активности фермента не столь значительное. Кроме того, может быть незначительное увеличение активности фермента при заболеваниях, сопровождающихся сходной клинической картиной с острым панкреатитом: остром аппендиците, перитоните, прободной язве желудка и т.д.
Следовательно, резко выраженная амилаземия позволяет отдифференцировать острый панкреатит от хронических заболеваний поджелудочной железы, а также от других острых заболеваний брюшной полости.
Почти всегда амилаземия сопровождается амилазурией. Но определение активности амилазы мочи является менее точным показателем диагностики, т.к. выход амилазы в мочу связан с функцией почек. Незначительное повышение амилазы в крови при снижении ее уровня в моче можно объяснить нарушением выделительной функции почек.
Снижение амилазной активности наблюдается при некрозе поджелудочной железы, заболеваниях печени (гепатиты, циррозы), обширных ожогах, сахарном диабете, кахексии и т.д.
Литература
Инструктивно-нормативная документация:
1. Приказ М3 РФ № 380 от 25.12.97 г. «О состоянии и мерах по совершенствованию лабораторного обеспечения диагностики и лечения пациентов в учреждениях здравоохранения РФ».
2. Приказ М3 РФ № 220 от 26.05.03 г. «Об утверждении отраслевого стандарта «Правила проведения внутрилабораторного контроля качества количественных методов клинических лабораторных исследований с использованием контрольных материалов».
3. Рекомендации М3 РФ «Правила по охране труда в клинико- диагностической лаборатории», 2002.
4. Приказ М3 РФ № 408 от 12.07.89 г. «О мерах по снижению заболеваемости вирусным гепатитом в стране».
Основные источники:
1. Ермолаев, М. В., Ильичева, Л. П. Биологическая химия: учебник / М. В. Ермолаев, J1. П. Ильичева. - М., Медицина, 1989.
2. Пустовалова, Л. М. Основы биохимии / Л. М. Пустовалова. - Ростов н/Д.: Феникс, 2003. - 448 с.
Дополнительные источники:
1. Бышевский, А. Ш., Галян, С. Л., Терсенов, О. А. Биохимические сдвиги и их оценка в диагностике патологических состояний / А. Ш. Бышевский и др. - М.: «Медицинская книга», 2002. - 318 с.
2. Камышников, В. С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике (в 2-х томах) / В. С. Камышников. - Минск, 2002.
3. Маршалл, В. Дж. Клиническая биохимия / В. Дж. Маршалл. - М.: Бином, 1999. - 367 с.
4. Медведев, В. В., Волчек, Ю. 3. Клиническая лабораторная диагностика / В. В. Медведев, Ю. 3. Волчек. - СПб.: «Гиппократ», 2006. - 359 с.
5. Медицинские лабораторные технологии: справочник. - СПб.: Интермедика, 2002. - 408 с.
6. Николаев, А. Я. Биологическая химия / А. Я. Николаев. - М.: МИА, 2001.
7. Обеспечение качества лабораторных исследований. Справочное пособие / под ред. проф. В.В. Меньшикова. - М.: ЮНИМЕД-пресс, 2003. - 312с.
8. Совершенствование качества работы клинико-диагностических лабораторий. Методическое пособие. - М.: ЗАО «Вектор-Бест», 2001. - 72 с.
9. Хиггинс, К. Расшифровка клинических лабораторных тестов / К. Хиггинс. - М.: Бином, 2004. - 375 с.
Дата добавления: 2015-07-11; просмотров: 882 | Нарушение авторских прав