Реакция иммунофлюоресценции

Иммунофлюоресценция — это метод, основанный на использовании специфичности иммунологической реакции и чувствительности флюоресцентной микроскопии. В отличие от других методов маркировки постановка пробы и точная локализация иммунной реакции на поверхности клетки или ткани происходят довольно быстро. Один из компонентов иммунной реакции, как правило антитело, метится флюоресцирующим красителем (маркировка, конъюгирование). После возбуждения флюоресцирующего агента положение антигена становится доступным непосредственному наблюдению вследствие развития флюоресценции.

Иммунофлюоресцентный метод (РИФ, реакция иммунофлюоресценции, реакция Кунса) - метод выявления специфических АГ с помощью АТ, конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

Предложенный в 1941 г. Кунсом, этот метод после многочисленных усовершенствований прочно вошел в лабораторную практику. Метод включает следующие важные этапы:

— получение, характеристика и маркировка антисывороток;

— получение антигенного субстрата;

— проведение анализа, т. е. обработка флюоресцирующими антителами;

— микроскопический анализ флюоресценции препаратов.

В настоящее время используют преимущественно коммерческие препараты флюоресцирующих АС. Если необходимых флюоресцирующих сывороток нет, можно воспользоваться непрямым методом флюоресцентного маркирования, присоединив к исследуемому объекту антигена, к которому имеются меченые антитела. Очень редко приходится разрабатывать собственный препарат меченых флюоресцентным красителем антител. Работа с флюоресцирующими антителами, особенно оценка получаемых с их помощью результатов, требует определенных навыков. Всегда следует проводить анализ с учетом неспецифической или нежелательной специфической флюоресценции. Необходимо учитывать факторы, которые могут оказывать влияние на флюоресцентный анализ. К ним относятся:

► желательная специфическая флюоресценция: специфическое связывание меченых антител с соответствующим антигеном;

► неспецифическая флюоресценция: неспецифическое отложение флюоресцирующих конъюгатов на различных тканевых структурах, например, вследствие избытка красителя или взаимодействия меченых антител с Fc-рецепторами; включение метки в другие сывороточные белки, кроме Ig, и неспецифическое связывание этих белков, например альбумина, фибронектина, аутофлюоресценция;

► нежелательная специфическая флюоресценция: наличие перекрестных реакций или недостаточная специфичность самого конъюгата. В случае прямого иммунофлюоресцентного анализа возможно неспецифическое отложение меченых антител.

Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (идентификация возбудителя в исследуемом материале), а также для определения АТ и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток.

Обнаружение бактериальных и вирусных антигенов в инфекционных материалах, тканях животных и культурах клеток при помощи флюоресцирующих антител (сывороток) получило широкое применение в диагностической практике. Приготовление флюоресцирующих сывороток основано на способности некоторых флюорохромов (например, изотиоцианата флюоресцеина) вступать в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их иммунологической специфичности.

Различают три разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.

Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген - антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.

Механизм

На предметном стекле готовят мазок из исследуемого материала, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной кроличьей сывороткой, содержащей антитела против антигенов возбудителя. Для образования комплекса антиген — антитело препарат помещают во влажную камеру и инкубируют при 37 °С в течение 15 мин, после чего тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия для удаления не связавшихся с антигеном антител. Затем на препарат наносят флюоресцирующую антиглобулиновую сыворотку против глобулинов кролика, выдерживают в течение 15 мин при 37 °С, а затем препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия. В результате связывания флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки с фиксированными на антигене специфическими антителами образуются светящиеся комплексы антиген — антитело, которые обнаруживаются при люминесцентной микроскопии.

Дата добавления: 2015-10-13