Спиртового брожения

Использование брожений и других процессов метаболизма

СПИРТОВОЕ БРОЖЕНИЕ

Основные возбудители спиртового брожения дрожжи, играют большую роль в жизни человека. Дрожжи традиционно используют в хлебопечении, для получения спирта и многих дру­гих продуктов. По значимости для народного хозяйства c ними могут конкурировать только молочнокислые бактерии. Пожалуй, нет на земном шаре ни одного человека, который бы в своей повседневной жизни не пользовался «трудами» этих микроорга­низмов.

На Востоке в качестве возбудителя спиртового брожения при производстве рисового пива (сакэ) применяется Aspergillus oryzae. Спиртовое брожение могут вызывать также некоторые бактерии (Zymomonas mobilis, Z. anaerobica, Sarcina ventricula, Erwinia amylovora). Однако получение спирта с помощью этих микроорганизмов существенного промышленного значения пока не имеет.

Термином «дрожжи» обозначают одноклеточные эукариотные микроорганизмы, которые в зависимости от наличия и типа по­лового процесса относят к трем классам грибов: Ascomycetes, Basidiomycetes и Deuteromycetes. Термин «дрожжи» в строгом смысле не имеет таксономического значения. К классу Ascomycetes относят дрожжи, образующие при половом размножении сумки (аски) с эндогенными спорами. К нему принадлежат представители родов дрожжей, используе­мых в бродильных производствах, — Saccharomyces и Shizosaccharomyces. Класс Basidiomycetes включает дрожжи, формиру­ющие телиоспоры (телейтоспоры) и базидиоподобные спорофоры с экзогенными половыми спорами (споридиями). К Deuteromy­cetes, или несовершенным грибам, относят дрожжи, у которых не обнаружен половой цикл. Считают, что организмы, принад­лежащие к этой группе, произошли от высших грибов в резуль­тате утраты ими половых функций.

В процессе эволюции дрожжи хорошо приспособились к оби­танию в различных местах, содержащих чаще всего углеводы. Они растут на поверхности сладких плодов, в нектаре цветков, в сокотечениях деревьев, на поверхности листьев, в лесной подстилке и почве. Встречаются дрожжи и в водоемах. Содер жатся они в пищеварительном тракте человека и животных. Большинство дрожжей сапрофиты, но среди видов, находящихся во внутренних органах и на кожных покровах человека, имеются патогенные или условно- патогенные формы, например возбуди­тель кандидомикозов — Candida albicans. Некоторые дрожжи вызывают болезни растений.

ФИЗИОЛОГИЯ ДРОЖЖЕЙ и химизм

СПИРТОВОГО БРОЖЕНИЯ

Из, соединений углерода дрожжи, как правило, лучше всего используют гексозы. Некоторые виды хорошо растут на средах с пентозами. Из полисахаридов чаще всего утилизируют инулин и крахмал. Известны дрожжи, растущие на средах с углеводоро­дами и некоторыми спиртами, в том числе метанолом и этанолом, а также органическими кислотами и другими углеродными суб­стратами.

В качестве источника азота дрожжи используют обычно соли аммония, аминокислоты, небольшие пептиды, реже нитраты и нитриты. Некоторые виды нуждаются в одном или более вита­минах (чаще в биотине и тиамине), другие — способны все необ­ходимые для роста витамины синтезировать сами.

Большинство дрожжей растет в границах рН от 3,0 до 8,0, оптимальные значения рН от 3,5 до 6,5. Общий диапазон темпе­ратур для роста дрожжей довольно широк: от 0 (даже —7°С) до 48—50 °С. Оптимальная температура для роста большинства видов 28—30 °С, но некоторые расы дрожжей, например, исполь­зуемые в пивоварении, имеют более низкий температурный опти­мум. Известны также облигатно психрофильные дрожжи, не растущие при температуре выше 18—20 °С. Многие дрожжи — факультативные анаэробы. В условиях анаэробиоза они получа­ют энергию в результате сбраживания углеводов, а в присут­ствии молекулярного кислорода — за счет аэробного дыхания.

Спиртовое брожение у дрожжей до образования пировино- градной кислоты отличается от гликолиза у высших организмов лишь последними этапами, на которых вместо молочной кислоты образуется этиловый спирт. Обусловлено это наличием у дрож­жей пируватдекарбоксилазы, катализирующей превращение пирувата в ацетальдегид, который затем восстанавливается в этанол.

Гликолитическим путем (или путем Эмбдена — Мейергофа — Парнаса) осуществляется разложение глюкозы, галактозы, фруктозы и маннозы. Олигосахариды вначале гидролизуются соответ­ствующими ферментами до гексоз.

По-разному способны утилизировать дрожжи трисахарид раффинозу, которая определяется наличием в клетках дрожжей ферментов, расщепляющих этот углевод.

Существовало мнение, что дрожжи используют пентозы лишь в аэробных условиях. В последнее время установлено, что неко­торые из них способны к росту в анаэробных условиях на средах, содержащих ксилозу или ксилулозу; последние подвергаются брожению с образованием этанола. Это имеет важное практичес­кое значение для производств, перерабатывающих в спирт древе­сину и отходы сельскохозяйственных растений.

Разложение пентоз и высших спиртов осуществляется дрож­жами через пентозофосфатный и ФБФ-пути. Спирты вначале дегидрируются до соответствующих гексоз и пентоз.

Некоторые дрожжи (Rhodotorula, Sporobolomyces, Cryptococcus) используют сахара только в аэробных условиях. Неспособ­ность сбраживать глюкозу связывают с отсутствием у этих орга­низмов пируватдекарбоксилазы или НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы — ферментов, осуществляющих превращение пирувата в этанол.

Суммарная реакция его:

Глюкоза---------------- > 2СО₂ + 2 этанол

Таблица 21.1. Варианты использования раффинозы дрожжами

	Сбраживаемый сахар	Степень сбраживания молекул раффинозы
галактоза	глюкоза	фруктоза
	+	+	+	Полное
	—	+	+	На 2/3 (в остатке галактоза)
	—		+	» 1/3 (в остатке мелибиоза)
	+	—	—	» 1/3(в остатке сахароза)

Ход брожения может заметно меняться в зависимости от конкретных условий. Если в культуру бродящих дрожжей доба­вить бисульфит натрия, который связывает ацетальдегид, он исключается из последующего процесса и блокируется.

В таких условиях акцептором электронов (водорода) от НАДН становится дигидроксиацетонфосфат, превращающийся в глицерин-3~фосфат, а затем в глицерин. Суммарная реакция соответствует уравнению

Глюкоза----àглицерин + ацетальдегид (связанный) + СО₂

Суммарное количество синтезированной АТФ при такой фор­ме брожения равно нулю и, следовательно, процесс не может обеспечить рост клеток, но его используют в промышленности для получения глицерина.

Сходный вариант спиртового брожения наблюдается при вы­ращивании дрожжей в щелочной среде.

Суммарная реакция выражается уравнением:

2 глюкоза + Н₂0 --à2 глицерин + этанол + уксусная кислота + 2С0₂

Такой химизм процесса благоприятен для клеток, поскольку образующаяся уксусная кислота снижает рН среды, после чего вновь возобновляется нормальное спиртовое брожение.

В начальной стадии спиртового брожения дигидроксиацетон- фосфат также выполняет роль акцептора электронов до момента, пока не накопится ацетальдегид, необходимый для окисления НАДН. Этим объясняется наличие в начале брожения своеобразного периода индукции, во время которого появляется глицерин. Одновременно 3-фосфоглицериновый альдегид превращается в пировиноградную кислоту, последняя затем декарбоксилируется в ацетальдегид. Но ацетальдегид не может восстанавливаться в спирт, так как НАДН использован для образования глицерина из дигидроксиацетонфосфата. Поэтому при образовании в процессе брожения одной молекулы глицерина накапливается одна молекула пировиноградной кислоты или ацетальдегида, которая не превращает­ся в этиловый спирт. Спиртовое и глицеринпировиноградное брожение тесно связаны. Вначале преобладает глицеринопировиноградное брожение, но даже в период бурного брожения наряду со спиртом обнаруживаются другие продукты.

В присутствии молекулярного кислорода дрожжи быстро пе­реключаются с брожения на аэробное дыхание. При этом пиро­виноградная кислота, образующаяся из глюкозы и других суб­стратов, окисляется через цикл трикарбоновых кислот (ЦТК) до С0₂ и Н₂0. Кроме того, ЦТК обеспечивает клетки рядом метаболитов, необходимых для дальнейших биосинтети­ческих реакций. В энергетическом отношении дыхание более вы­годно, чем брожение. Поэтому в аэробных условиях дрожжи рас­тут лучше и образуют большую биомассу.

Подавление брожения -в аэробных условиях носит название эффекта Пастера. Он связан, видимо, с различием энергетиче­ского заряда клеток в аэробных и анаэробных условиях. Спиртовое брожение может происходить в условиях значительной аэрации при высоком содержании глюкозы в среде (1,5—2,0%). Подавление аэробного дыхания при высокой кон­центрации глюкозы (высокой скорости ее усвоения) называется эффектом Крэбтри или катаболитной репрессией. Этот эффект не наблюдается при выращивании дрожжей на средах, содержа­щих менее усваиваемые сахара. Катаболитная репрессия аэроб­ного дыхания снижает получение дрожжами энергии. Она подавляет биосинтез промежуточных продуктов ЦТК и глиоксилатного цикла. В таких условиях необходимые для биосинтеза кислоты ЦТК образуются путем карбоксилирования пирувата.

Пироииноградная кислота обнаруживается, как правило, в не­больших количествах. Основная ее часть идет на обра­зование различных вторичных продуктов. К ним относятся уксусная, молочная, янтарная, пропионовая, муравьиная и некоторые другие кислоты, ацетон, диацетил, ацетоин, 2,3-бутандиол, раз­личные альдегиды и сложные эфиры.

При сбраживании дрожжами сахаров обычно накапливается небольшое количество D(—) -молочной кислоты. Исключением является S. veronae, синтезирующий Ц+)-молочную кисло­ту. К продуктам брожения, образующимся из пировиноградной кислоты в небольшом количестве, относятся также лимонно- яблочная и диметилглицериновая кислота.

Кроме вторичных продуктов при спиртовом брожении обра­зуются побочные продукты — высшие спирты, известные под наз­ванием сивушных масел. Почти половину общего количества высших спиртов составляют два изоамиловых спирта: 3-метил-бутанол-(1) и 2-метилбутанол-(1). Наряду с ними в сивушном масле содержатся изобутиленовый, n-бутиловый, n-пропиловый и ароматические спирты (-фенилэтиловый, n-оксифенилэтиловый). Эти продукты синтезируются из соответствующих кетокислот, образующихся в результате метаболизма углеводов, или из аминокислот. Вторичные и побочные продукты существенно влияют на вкус и аромат готового продукта; накопление их не коррелирует с образованием этанола и сброженные растворы, содержащие одинаковое коли­чество спирта, могут отличаться по вкусовым и ароматическим качествам.

Образование высших спиртов включает дезаминирование аминокислоты в кетокислоту, которая декарбоксилируется в аль­дегид; последний восстанавливается в спирт.

Однако не все высшие спирты синтезируются из аминокислот. Второй путь их образования можно рассматривать как биосин­тез из продуктов метаболизма углеводов.

Полагают, что некоторые высшие спирты могут синтезиро­ваться обоими путями (из аминокислот и углеводов), другие— только из продуктов метаболизма углеводов.

При спиртовом брожении образуются также серусодержащие вещества — сероводород и сульфиты. Последние могут быть в форме ионов бисульфита (HSO₃ ^-) или сернистой кислоты (H₂SO₃). Синтез этих веществ связан со способностью дрожжей восстанавливать SO ₄^{2-- -}в S^2- через сульфит (SO₃^2--). Восста­новление сульфатов в сульфиты зависит от свойств штамма дрож­жей. На образование H₂S влияет интенсивность брожения, а так­же присутствие ионов меди и цинка.

Из других серусодержащих веществ в незначительном коли­честве могут образовываться меркаптаны (этилмеркаптаны, метилмеркаптаны) — летучие вещества с неприятным запахом. Выделение СО₂ при брожении способствует удалению этих ве­ществ из среды.

ХАРАКТЕРИСТИКА ДРОЖЖЕЙ, ПРИМЕНЯЕМЫХ

В ПРОМЫШЛЕННОСТИ

Дрожжи, используемые для получения спирта, относятся в основном к роду Saccharomyces. Систематика рода Saccharomyces неоднократно подвергалась пересмотру, номенклатура видов часто изменялась в зависимости от позиций авторов, придерживающихся тех или иных концепций в систематике дрож­жей.

В последнем руководстве по дрожжам (Ы. Kreger-van-Rij, 1984) к роду Saccharomyces отнесено семь видов, размножаю- щихся ^вегетативно преимуще­ственно в диплоидной фазе: Sacch. cerevisiae, S. kluyveri, S. exiguus, S. dairensis, S. servazzii, S. tellustris, S. unisporus. Как синонимы S, cere visiae рассматриваются S. bayanus, S. carlsbergensis и ряд других промышленно важных дрожжей.

Наибольшее значение имеет S. cerevisiae. К этому виду относятся расы дрожжей, используемые в хлебопечении, спирто­вом производстве, пивоварении, виноделии, производстве кваса. Поэтому приводим характеристику вида.

Saccharomyces cerevisiae Hansen. На солодовом сусле в трехсуточной культуре при 28 °С клетки имеют сферическую, эллипсоидальную или несколько удлиненную формы; располага­ются единично или парами, иногда образуют короткие цепочки или мелкие грозди (рис.1). В зависимости от размера клеток штаммы этого вида можно - разделить на три морфологические группы.

К первой группе относятся штаммы, имеющие самые крупные клетки (3,5—10,5X5,0 — 21,0 мкм), ко второй — с наимень­шими (2_;5—7,0X11)0—19,0 мкм) к третьей — промежуточные (3,5 — 8,0X5,0— 11,5— 18,0 мкм). Некоторые штаммы образуют удлиненные клетки, достигающие 30 мкм и более.

Колонии у этих дрожжей пастообразные, кремовые или коричневато-кремовые, обычно с довольно ровной, гладкой, иногда слегка пузырчатой или покрытой точками поверхностью, с блес­тящими или тусклыми секторами. Край колоний цельный, иногда лопастный, изредка образуется примитивный псевдомицелий.

Аскообразование легко вызвать при высеве дрожжей на агар с ацетатом. Аски обычно содержат от одной до четырех спор шаровидной или эллипсоидальной формы. Сбраживает глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу и на '/з раффинозу. В аэробных условиях использует глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, на /з раффинозу. Способность к использованию L-сорбозы, трегалозы, мелецитозы, инулина, L-арабинозы, D-рибозы, глицерина, D-маннита, D-сорбита, -метил-D-глюкозида и молочной кислоты варьирует. Не ассимилирует целлобиозу, лактозу, мелибиозу, крахмал, ксилозу, D-арабинозу, L-рамнозу, эритрит, рибит, дульцит, салицин, янтарную и лимонную кислоты, инозит. Не исполь­зует в качестве источника азота NO3". Штаммы имеют различ­ную способность расти на средах в отсутствие витаминов.

В странах Африки для получения алкогольных напитков ис­пользуют делящиеся дрожжи Schizosaccharomyces (S. pombe и S. octosporus).

В пищевой промышленности дрожжи, не принадлежащие к сахаромицетам, играют, как правило, отрицательную роль, нару­шая ход технологического процесса и вызывая порчу сырья и го­товой продукции. Штаммы S. cerevisiae подразделяют на расы низового и верхового брожения. К расам низового брожения относится большинство винных и пивных дрожжей, к расам верхового — спиртовые, хлебопекарные и некоторые пивные. Дрожжи низово­го брожения функционируют в производстве при температуре 6—10 °С и ниже (до 0°С), а верхового — обычно при 14—25 °С.

В конце брожения низовые дрожжи оседают на дно, форми­руя плотный осадок, верховые — всплывают на поверхность и об­разуют «шапку». Способность последних подниматься на поверх­ность обусловлена тем, что клетки после почкования остаются соединенными в небольшой цепочке; пузырьки углекислого газа поднимают их на поверхность. Оба свойства, однако, не абсо­лютны.

По поведению в бродящей среде дрожжи разделяют также на хлопьевидные и пылевидные. В основе этого разделения лежит различие в их флокуляционных свойствах (флокуляция— обра­тимая агрегация, или агглютинация, клеток).

Хлопьевидные дрожжи в конце брожения слипаются в комки («флокулы») и либо оседают на дно, либо поднимаются на поверхность. Пылевидные дрожжи в течение всего процесса бро­жения находятся во взвешенном состоянии. Флокулируют дрож­жи как низового, так и верхового брожения. Клетки хлопьевид­ных дрожжей крупнее и тяжелее, чем пылевидных; последние особенно подвержены автолизу. Пылевидные дрожжи дают мень­ший прирост биомассы, но обладают более высокой бродильной активностью и полнее сбраживают сусло, образуют больше диацетила и высших спиртов. Хлопьевидные дрожжи лучше создают аромат напитков. Способность дрожжей к хлопьеобразованию не является стойким признаком, и штаммы могут ее постепенно утрачивать.

Во второй половине прошлого века кустарные бродильные производства были преобразованы в крупные, индустриальные. Одна из существенных трудностей, с которой столкнулась при этом промышленность, — развитие инфекции, наносившей осо­бенно ощутимый урон. Применение чистых культур специально селекционированных микроорганизмов — важный этап борьбы за качество и чистоту процесса брожения.

Чистые культуры дрожжей размножают в производственных лабораториях на оптимальных для их роста средах, пересевая во все возрастающие емкости. В стадии высокой физиологиче­ской активности культуры передают в цех, где продолжают выра­щивать в дрожжерастительных аппаратах на обогащенных про­изводственных субстратах и затем используют в технологическом процессе. В цехах создают условия, необходимые для жизнедея­тельности дрожжей в заданном направлении и позволяющие подавить рост вредных микроорганизмов. Их развитие ингибируется рядом воздействий (введением антисептических веществ, большим засевом маточных дрожжей и др.), а также стремятся сохранить «естественную чистоту культуры».

На заводах в процессе длительного культивирования, особен­но при непрерывных способах брожения, в результате спонтан­ного мутагенеза в дрожжевой популяции могут накапливаться мутанты, более приспособленные к условиям производства по сравнению с исходной расой.

Отбор новых рас дрожжей, как правило, проводят из фермен­теров, в которых процесс брожения проходил с наиболее высо­кими показателями. Выделенные штаммы исследуют в лабора­торных и производственных условиях. Расы, дающие наилучшие показатели брожения, становятся производственными и широко применяются в практике.

Изредка дрожжи, обладающие ценными производственными свойствами, удавалось выделять и из природных субстратов, условия развития в которых содействовали отбору нужных свойств. Так, в частности, в Средней Азии была выделена раса S. cerevisiae Ркацители-6, широко используемая для произ­водства вина в различных эколого-географических районах Со­ветского Союза.

Многие попытки селекционировать дрожжи бродильных рас получают при искусственном воздействии мутагенных факторов. Однако, мутанты, проявляющие ценные свойства в лабо­раторных условиях, часто не выдерживают конкуренции в производственных условиях и вытесняются.

В последние годы при селекции рас дрожжей для ряда отрас­лей промышленности (производство спирта из мелассы, хлебопе­чение) с успехом применяют метод гибридизации.

Методы генетической инженерии открывают новые пути для получения высокоэффективных рас дрожжей.

Дата добавления: 2015-08-21