Регуляция активности ферментов

Задание 3. ИНГИБИТОРЫ И АКТИВАТОРЫ ФЕРМЕНТОВ.

1. В метаболической цепи реакций реакция, катализируемая ферментом Е₁, протекает с наименьшей скоростью:

Какой фермент может быть регуляторным в данной цепи реакций? Какой из продуктов реакций (Р₁, Р₂, Р₃, Р_n) может служить ингибитором метаболического пути? Объясните, почему. Назовите тип регуляции. Каковы структурные особенности регуляторного фермента?

2. Обратимо ли действие ингибиторов в следующих реакциях? Требуется

обосновать ответ, используя данные по инактивации ферментов, приведенные в уравнениях.

3. Модуляторами регуляторного фермента могут быть молекулы субстрата и молекулы продукта реакции, катализируемой ферментом. Как изменяется скорость реакции, катализируемой регуляторными ферментами, под влиянием субстрата и под влиянием продукта реакции? Какое биологическое значение имеет каждый из этих типов модуляции?

4. Фермент изоцитратдегидрогеназа катализирует реакцию превращения изоцитрата в α-кетоглутарат. АТФ является отрицательтным эффектором фермента, а АДФ - его положительным эффектором. Объясните механизм регуляции фермента. Дайте графическое изображение кинетики данной ферментативной реакции.

5. Определите тип ингибирования, проанализировав приведенные ниже данные зависимости степени ингибирования фермента глутаматдегидрогеназы аспартатом и салицилатом. Требуется учесть, что в обоих случаях активность фермента можно восстановить, удалив ингибитор. Ответьте на вопросы:

1) какое из веществ является конкурентным ингибитором, какие результаты это доказывают?

2) какой метод можно использовать для удаления ингибитора?

6. Ингибирование аспартатом (концентрация аспартата постоянна)

Ингибирование салицилатом (концентрация салицилата постоянна)

7. Определить константу неконкурентного ингибирования этанолом роста термофильной водородобразующей бактерии в условиях S₀ > K_s, используя исходные данные:

Концентрация этанола, мМ	m, ч^-1
	0,55 0,46 0,38 0,27 0,14

8. Ферментативная реакция (K_M = 2.7^.10^-3 моль/л) подавляется конкурентным ингибитором (K_I = 3.1^.10^-5 моль/л). Концентрация субстрата равна 3.6^. 10^-4 моль/л. Сколько ингибитора понадобится для подавления реакции на 65%? Во сколько раз надо повысить концентрацию субстрата, чтобы уменьшить степень подавления до 25%?

9. Реакция гидролиза сахара при участии фермента-катализатора:

Сахароза + H₂O = глюкоза +фруктоза

протекает в следующем направлении:

Время (мин)	Концентрация сахарозы, М
	0,5011
	0,4511
	0,4038
	0,3626
	0,3148
	0,2674

Определить константу реакции первого порядка и время полуреакции. Почему эта бимолекулярная реакция следует закону скорости реакции первого порядка? Как долго будет проходить гидролиз в присутствии 99% сахарозы в начальной стадии? Как долго будет идти реакция, если количество сахарозы, присутствующей на начальной стадии, в два раза больше, чем дано в таблице?

10. Фермент конкурентно ингибируется в разной степени при одной и той же концентрации трех ингибиторов I₁, I₂ и I₃. Константы диссоциации ингибиторов K (I₁) = 0.1 ммоль/л, K (I₂) = 0.01 ммоль/л, K (I₃) = 1.0 ммоль/л. Какой ингибитор будет вызывать наибольшее ингибирование? Наименьшее?

11. Исследовано влияние ряда соединений на активность кристаллической карбоксипептидазы в опытах по гидролизу L-карбобензоксиглицил-L-фенилаланина. Полученные данные приведены в таблице:

Условия	Исходная концентрация субстрата, моль/л	Скорость реакции, усл. ед.
Отсутствует	0.0713 0.0581 0.0384 0.0285 0.0125	166.0 142.6 111.0 111.0 66.0
Бензойная кислота, 0.05 моль/л	0.1000 0.0250 0.0500 0.0175	40.8 38.4 33.3 30.3

Определите тип ингибирования.

12. Известно, что карбоангидраза сильно ингибируется ацетазоламидом, применяемым как мочегонное средство и как препарат для лечения глаукомы, характеризующейся чрезмерным повышением внутриглазного давления. В этих и других секреторных процессах карбоангидраза играет важную роль, поскольку она участвует в регуляции рН и содержания бикарбоната во многих жидкостях организма человека.

На рисунке показана экспериментальная кривая, выражающая зависимость скорости реакции, катализируемой карбоангидразой, от концентрации субстрата. При проведении опыта в присутствии ацетазоламида получается нижняя кривая. Исходя из анализа кривых и Ваших знаний о кинетических свойствах конкурентных и неконкурентных ингибиторов ферментов, определите природу ингибирования ацетазоламидом. Объясните, на чем основано Ваше утверждение.

13. Как известно, многие ферменты необратимо ингибируются ионами тяжелых металлов, такими, как Mg²⁺, Cu²⁺ или Ag⁺, которые могут взаимодействовать с важными для активности фермента сульфгидрильными группами с образованием меркаптидов:

Е–SH + Ag⁺ → Е–S–Ag + H⁺.

Сродство ионов Ag⁺ к сульфгидрильным группам столь велико, что эти ионы можно использовать для количественного титрования -SH-групп. К 10 мл раствора, содержащего 1 мг/мл чистого фермента, добавили такое количество AgNO₃, которое достаточно для полной инактивации фермента. Для этого потребовалось 0.342 мкмоль AgNO₃. Рассчитайте минимальную молекулярную массу фермента. Почему значение молекулярной массы, полученное таким путем, будет минимальным?

14. Измеряли кинетику ферментативной реакции в зависимости от концентрации субстрата в присутствии или в отсутствие ингибитора. Были получены следующие данные:

[S], моль/л	Скорость реакции, мкмоль/мин
без ингибитора	с ингибитором
0.3·10^–5 0.5·10^–5 1.0·10^–5 3.0·10^–5 9.0·10^–5	10.4 14.5 22.5 33.8 40.5	4.1 6.4 11.3 22.6 33.8

а) Чему равны V _max и K _М в отсутствие ингибитора и в присутствии его?

б) Каков тип ингибирования?

в) Чему равна константа связывания ингибитора?

г) Если [S] = 1·10^–5 моль/л и [I] = 2·10^–5 моль/л, то какова доля молекул фермента, связавших субстрат; связавших ингибитор?

15. Декарбоксилирование глиоксилата митохондриями ингибируется малонатом. При кинетическом исследовании были получены следующие результаты:

Концентрация глиоксилата, ммоль/л	Скорость выделения СО2 (условные единицы)
в отсутствие малоната	при концентрации малоната 1.26 млмоль/л	при концентрации малоната 1.96 млмоль/л
1.00 0.75 0.60 0.50 0.40 0.33 0.25	2.50 2.44 2.08 1.89 1.67 1.39 1.02	2.17 1.82 1.41 1.30 1.09 – –	1.82 1.39 1.28 1.00 – – 0.56

Определите, является ли малонат конкурентным ингибитором?

16. Исследовано влияние ряда соединений на активность кристаллической карбоксипептидазы в опытах по гидролизу L-карбобензоксиглицил-L-фенилаланина. Полученные данные приведены в таблице:

Условия	Исходная концентрация субстрата, моль/л	Скорость реакции, усл. ед.
Отсутствует	0.0713 0.0581 0.0384 0.0285 0.0125	166.0 142.6 111.0 111.0 66.0
Гидрокоричная кислота, 0.002 моль/л	0.1000 0.0500 0.0400 0.0250	16.0 11.1 7.6 5.5

Определите тип ингибирования.

17. При исследовании кинетики действия амилазы на крахмал, в том числе влияния продуктов гидролиза в качестве ингибиторов, были получены следующие результаты:

Ингибитор	Концентрация ингибитора, мг/мл	Концентрация субстрата, мг/мл
11.52	5.76	2.88	1.44
Относительные скорости гидролиза
Отсутствует	0.00
а) Мальтоза	6.35 12.70 25.40
б) Предельный декстрин	6.68 13.35 26.70

Определите константу Михаэлиса фермента, максимальную скорость, установите тип ингибирования и вычислите соответствующие значения констант процесса распада комплекса фермент-ингибитор.

18. Зависимость скорости реакции, катализируемой транскарбамоилазой, от концентрации субстрата выражается кривой, имеющей сигмоидную форму. После обработки фермента солями ртути каталитическая активность увеличилась примерно в 4 раза, а кривая зависимости скорости реакции от концентрации субстрата приобрела форму гиперболы. Нарисуйте график, иллюстрирующий приведенные данные. Какие выводы о структуре и внутримолекулярных взаимодействиях в ферменте можно сделать на основании этих данных?

19. Пестицид ингибирует активность данного фермента А, и, следовательно, последний может применяться для определения пестицида в пробах неизвестного состава.

а) В лабораторных экспериментах измерены начальные скорости реакции; результаты экспериментов:

v, моль/(л^.мин)^.10⁶

[S],моль/л В отсутствие В 10^-5 М растворе

ингибитора ингибитора

3,3^.10^-4 56 37

5,0^.10^-4 71 47

6,7^.10^-4 88 61

1,65^.10^-3 129 103

2,21^.10^-3 149 125

Каким ингибитором является этот пестицид, конкурентным или неконкурентным? Определите величины К_I, V_max и K_м.

б) Раствор фермента (50мл) смешали с 50 мл 8^.10^-4 М раствора субстрата и 25 мл пробы; начальная скорость реакции составила 18 мкмоль/(мин^.л). Какова концентрация ингибитора в пробе, если последняя не содержит других ингибиторов (кроме пестицида) и субстратов?

Рекомендуемая литература

1. Комов В.П. Биохимия: учеб. для вузов / В.П. Комов, В.Н. Шведова.– М.: Дрофа, 2004.- 638 с.

2. Жеребцов, Н.А. Биохимия / Н.А. Жеребцов. – Воронеж, 2002. – 696 с.

3. Плакунов В.К. Основы энзимологии. М.: Логос, 2002. – 128 с. (с. 37, 38).

4. Ленинджер А. Основы биохимии: в 3 т. - М.: Мир, 1985. Т.1.Глава 9. Ферменты.

5. Квеситадзе Г. И., Безбородов А. М.; Российская академия наук; Институт биохимии им. А.Н. Баха. — Москва: Наука, 2002.— 284 с. (206-229)

6. Биотехнология: учебное пособие для вузов / Ю.О. Сазыкин, С.Н. Орехов, И.И. Чакалева; Под ред. А.В. Катлинского.— М.: Академия, 2006.— 254 с.(с. 56-73).

7. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. — М.: Высшая школа, 1980. — 272 с.

8. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: Практический курс. - М.: ФААИР-ПРЕСС, 1999. - 720 с.

Дата добавления: 2015-08-10