Мутаторный фенотип

Несмотря на обилие эндогенных и экзогенных мутагенов, лишь небольшая часть их взаимодействий с ДНК завершается образованием мутаций. Для того чтобы исходное повреждение ДНК в виде аддукта, апуринового сайта или одноцепочечного разрыва закрепилось в геноме в виде мутации, ему необходимо избежать нейтрализующего действия многочисленных ферментов системы репарации ДНК. В экспериментальных условиях для получения требуемых мутаций с помощью химических мутагенов и последующего скрининга требуется большая доза суммарного мутагенного воздействия. Из экспериментальных кривых "доза–эффект" видно, что число возникающих мутаций прямо пропорционально дозе мутагенного воздействия. Исходя из этого уже a priori можно предположить, что повреждение отдельных компонентов системы репарации должно приводить к возрастанию выхода мутаций в ответ на определенную дозу мутагенного воздействия. Действительно, описаны многочисленные штаммы микроорганизмов и линии соматических клеток с повышенными частотами спонтанных мутаций. Совокупность признаков организма, для которой характерна повышенная частота образования спонтанных мутаций, получила название мутаторного фенотипа.

Исследование молекулярно-генетических механизмов, приводящих к формированию мутаторного фенотипа, позволило обнаружить отдельные гены, ответственные за этот процесс. Такие гены называют генами-мутаторами, или просто мутаторами. Прежде всего, к ним относятся многие гены системы репарации ДНК, контролирующие разные ее этапы (подробнее см. раздел 5.3). Другие гены, мутации в которых приводят к мутаторному фенотипу, кодируют ферменты матричного синтеза нуклеиновых кислот. Описаны мутационные замены отдельных аминокислотных остатков в ДНК-полимеразах, которые понижают специфичность выбора дезоксирибонуклеозидтрифосфатов из внутриклеточного пула в соответствии с последовательностью матричной ДНК. Следствием этого является повышение частоты включения некомплементарных матрице нуклеотидов в строящиеся цепи ДНК. Однако сам процесс включения некомплементарных матрице нуклеотидов является лишь одной из стадий, критических для контроля точности репликации ДНК. Благодаря наличию у ДНК-полимераз корректирующей 3’→5’-экзонуклеазной активности ошибочно включенные некомплементарные матрице нуклеотиды тотчас удаляются из строящейся цепи ДНК, что защищает ее от точковых мутаций, возникающих по такому механизму. Поэтому неудивительно, что мутации, нарушающие функционирование корректирующей экзонуклеазной активности, также приводят к возникновению мутаторного фенотипа. К аналогичным эффектам приводят нарушения функционирования систем рекомбинации, транскрипции, систем контроля структуры хроматина, ферментных систем, контролирующих сегрегацию хромосом и число копий индивидуальных генов, а также систем, участвующих в синтезе эндогенных мутагенов. Нарушения функционирования и координации экспрессии генов метаболизма нуклеотидов также приводят к мутаторному фенотипу. Известно, что повышение внутриклеточной концентрации дезоксирибонуклеозидтрифосфатов сверх оптимального уровня понижает точность репликации ДНК. Мутаторный фенотип после возникновения начинает имитировать непрерывное мутагенное воздействие, интенсивность которого зависит от характера повреждений генов-мутаторов.

Мутаторный фенотип у микроорганизмов проявляется в повышенной частоте возникновения спонтанных мутаций, которые можно измерить по частоте появления клеток, выживающих в селективных условиях, например в присутствии антибиотиков. У эукариот мутаторный фенотип часто сопровождается дестабилизацией генома, обнаруживаемой по возрастанию частоты внутригеномных перестроек ДНК. В связи с этим явлением наиболее интенсивно исследуются изменения структуры микросателлитных повторов в геноме человека при онкологических заболеваниях. Сравнение структуры отдельных микросателлитных локусов в клетках опухолей и нормальных тканей одного индивидуума часто обнаруживает существенные различия между микросателлитами одного и того же локуса. Такого рода исследования чаще всего проводятся с помощью ПЦР или любого другого метода, используемого при ДНК-типировании (см. главу 10).

Рис. I.54. Примеры нестабильности микросателлитов (а, на примере карциномы молочной железы) и потери гетерозиготности (б, на примере глиомы) при различных онкологических заболеваниях. Показаны продукты ПЦР после разделения с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.

Н – нормальная ткань, О – опухоль. Стрелки указывают на измененные аллели

Наиболее просто обнаруживаются два типа изменений микросателлитов при мутаторном фенотипе (рис. I.54). При одном из них изменение суммарной длины микросателлитных повторов конкретного генетического локуса обнаруживают по возрастанию или уменьшению электрофоретической подвижности соответствующих продуктов ПЦР при сравнении его состояния в опухолевых и нормальных тканях одного и того же организма (см. рис. I.54, а). В исследованиях подобного рода часто наблюдают эффект так называемой потери гетерозиготности исследуемых микросателлитных локусов. Ввиду диплоидности генома человека каждый микросателлитный локус в нем представлен двумя копиями и, следовательно, двумя аллелями в случае его гетерозиготности. При ее потере происходит выравнивание длины обоих микросателлитных аллелей, которые различаются в нормальных тканях, или удаление одного из аллелей в результате делеции. Удаление фиксируют электрофоретически по исчезновению одного из продуктов ПЦР после амплификации соответствующих локусов, не сопровождаемому появлением новых полос (см. рис. I.54, б).

Дестабилизация микросателлитных локусов в опухолевых клетках, по-видимому, не служит непосредственной причиной малигнизации этих клеток. Нестабильность микросателлитов скорее может быть чувствительным маркером мутаторного фенотипа раковых клеток, внешним проявлением дестабилизации генома, характерного для опухолевых клеток многих типов. Варьирование размеров микросателлитных локусов является частным случаем большой группы мутаций, связанных с изменением числа копий последовательностей нуклеотидов в геноме эукариот. В качестве еще одного примера мутаций этого рода рассмотрим изменения размеров небольших кластеров ди- и тринуклеотидных повторов в геномной ДНК. Недавно было установлено, что такие мутации, получившие название экспансии ДНК, лежат в основе многих тяжелых заболеваний человека.

Дата добавления: 2015-08-18