|
Читайте также: |
Прокариоты характеризуются неодинаковой способностью использовать в метаболизме различные соединения углерода. Чтобы выяснить такие особенности, микроорганизмы высевают на синтетические среды, содержащие в качестве единственного источника углерода различные моно-, ди- и полисахариды, многоатомные спирты, органические кислоты, углеводороды (среды Гисса или так называемый «пестрый ряд»). Рост микроорганизмов на таких средах часто сопровождается накоплением органических кислот и газов, что регистрируют по изменению рН среды. Для этого в среды добавляют индикаторы (чаще бромтимоловый синий) из расчета 2 мл 1,6 % спиртового раствора на 1 литр среды. Среды засевают суспензией клеток микроорганизмов и термостатируют 1–5 суток. Рост на среде с данным источником углерода определяют по помутнению среды, образованию пленки или осадка, изменению цвета питательной среды, которое указывает на образование кислых или щелочных продуктов метаболизма. Об образовании газа свидетельствует его накопление в поплавке (при посеве в жидкую среду) или разрывы в агаризованной среде. Для обнаружения фермента лактазы (расщепляющего молочный сахар – лактозу) используют плотные дифференциально-диагностические среды (Эндо, Плоскирева), содержащие лактозу и индикатор. Бактерии, способные сбраживать лактозу, дают на среде окрашенные колонии, вследствие изменения рН среды.
Среды Гисса (пестрый ряд). Состоят из питательного агараили или бульона (100 мл) с добавлением 1 % р-ра различных сахаров (лактозы, глюкозы, мальтозы, маннита, сахарозы) и красителя бромтимолового синего или индикатора Андреде (кислый фуксин в 1 н. р-ре гидроксида натрия). Готовые среды синего цвета (с индикатором Андреде бесцветные). При ферментации соответствующего сахара бактериями выделяются кислоты и цвет среды изменяется на зеленый затем на желтый (среды с индикатором Андреде краснеют).
Результаты фаготипирования регистрируют с учетом степени лизиса по четырехкрестной системе: + + + + сливной (полный) лизис +++ полусливной (незначительный) лизис, рост культуры в зоне лизиса + + наличие в месте нанесения капли фага свыше 50 колоний фага (пятен лизиса) + от 20 до 50 колоний фага ± менее 20 колоний фага — полное отсутствие лизиса Для упрощения схемы учета степеней лизиса обозначения +'+ + +, + ++ и ++ относят к «сильным реакциям» и выражают + +. Штаммы стафилококка считаются типирован-ными, если хотя бы один фаг вызвал явления лизиса на + - К Более слабые степени лизиса не учитывают. Следовательно, если при первичном типировании штамма (1 ТР) один или несколько фагов дали лизис на +, такие штаммы следует типировать повторно 100 ТР. Если при повторном типировании штамма имеет место лизис на +, такие штаммы считают нетипируемыми.
При регистрации результатов типирования против каждого исследованного штамма записывают: номер фага, давшего лизис на ++, а также степень разведения фага (1 ТР и 100 ТР). В скобках можно отметить номер фагов, давших лизис на + или ±. Учет такого лизиса, не являясь достаточно показательным для характеристики штамма, может, однако, помочь установлению идентичности нескольких штаммов, что «меет значение при эпидемиологическом обследовании. Штаммы стафилококков лизируются чаще всего не одним, а несколькими фагами, что дает для каждого штамма характерную фагомозаику. В зависимости от фагов штаммы стафилококков могут относиться к какой-либо одной (I, II, Ш или IV) группе или к смешанным группам (например, I и III). Определение энтеротоксина стафилококков. Штаммы стафилококков, выделенные при пищевых отравлениях, испытывают на наличие энтеротоксина следующим образом. Одну петлю суточной агаровой культуры стафилококка вносят в колбу, содержащую 50 мл питательной среды, предназначенной специально для накопления стафилококкового энтеротоксина (рец. 64). Колбу помещают в эксикатор, в котором воздух замещен 20% углекислотой.
Для этого на дно сосуда емкостью 2 л насыпают 2 г двууглекислой соды. Крышку эксикатора смещают по ранту, смазанному смесью вазелина с ланолином в отношении 1: 1 так, чтобы осталась небольшая щель, через которую можно ввести пипетку и влить в соду 17 мл 10% серной кислоты. После этого крышку плотно притирают к эксикатору. Посевы инкубируют в термостате при 37°С, ежедневно насыщая среду эксикатора новой порцией углекислоты. На 4-й день колбу с засеянной средой вынимают из термостата и содержимое ее фильтруют через мембранные фильтры № 3 или 4 (см. с. 24). Полученный фильтрат в количестве 10—15 мл смешивают с равным количеством теплого молока и скармливают котятам 4—8-недельного возраста с массой тела 350—600 г. При наличии энтеротоксина в исследуемом фильтрате спустя несколько минут после приема его котята начинают проявлять беспокойство, а через 1—3 ч возникают симптомы гастроэнтерита: многократный понос с выделением испражнений слизистого характера, в редких случаях с примесью крови, рвота. Понос, являясь обязательным симптомом стафилококковой интоксикации, продолжается иногда в течение 2—3 дней; в тяжелых случаях котята погибают. Определение стафилококкового антитоксина в сыворотке - крови. Многие заболевания стафилококковой этиологии, особенно с глубокой локализацией патологического очага (остеомиелиты, септикопиемические процессы), сопровождаются постоянным поступлением больших количеств стафилококкового антигена в русло крови, стимулируя тем самым формирование специфических антител, одним из которых является стафилококковый антитоксин, нейтрализующий гемолитические свойства стафилококкового токсина. У здоровых людей, так же как у лиц, перенесших стафилококковую инфекцию кожных покровов или гнойное хирургическое заболевание, титр стафилококкового антитоксина не превышает 2 АЕ.
Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам методом дисков (диффузионный тест)
Метод основан на подавлении роста микроорганизмов на плотной питательной среде под действием антимикробного препарата, нанесенного на бумажный диск (в продаже имеются готовые стандартные бумажные диски с широким ассортиментом современных препаратов в строго определенной концентрации, которую определяют исходя из терапевтических концентраций). В результате диффузии препарата в среду вокруг диска образуется градиент концентрации антибиотика – зона подавления роста микроорганизмов. Размер зоны подавления роста зависит от чувствительности бактерий и свойств препарата.
Для проведения исследования готовят взвесь, содержащую стандартное количество жизнеспособных клеток, которую засевают газоном на поверхность плотной питательной среды (Мюллер-Хинтон или агар АГВ, не препятствующий диффузии препаратов) в чашки Петри. Диски с препаратами накладывают на посев на расстоянии 2,5 см от центра чашки по кругу (на одну чашку не более 5 дисков). Посевы инкубируют 18–20 часов при 35ºС. При соблюдении методики на фоне равномерного бактериального газона вокруг дисков образуются зоны подавления роста круглой формы. Учет результатов осуществляют путем измерения диаметра зоны подавления роста. За зону, подлежащую измерению, принимают тот участок, на котором рост бактерий полностью отсутствует. Интерпретацию полученных результатов осуществляют на основании критериев, приведенных в Приложении 2.
Применение метода дисков имеет ряд ограничений. Метод пригоден только для определения чувствительности быстрорастущих бактерий, образующих в течение 24 часов гомогенный газон на стандартной плотной питательной среде достаточно простого состава (Мюллер-Хинтон или агар АГВ). В противном случае полученная информация будет недостоверной. Таким образом, метод дисков не может быть использован для определения чувствительности к антибиотикам всех медленно растущих и большинства прихотливых бактерий, к числу которых относятся многие возбудители болезней человека (Mycobacterium spp., Helicobacter spp., Bacteroides spp. и многие другие). Метод дисков не дает надежных результатов также при определении чувствительности бактерий к препаратам, плохо диффундирующим в агар, например, полипептидным антибиотикам (полимиксин, ристомицин).
Количественное определение чувствительности бактерий к антимикробным препаратам методом серийных разведений.
Данный метод применяют для определения минимальной подавляющей концентрации (МПК) – наименьшей концентрации антибиотика, полностью подавляющей рост исследуемых бактерий. Готовят основной раствор антибиотика, содержащий препарат в определенной концентрации (мкг/мл или ЕД/мл) в физиологическом или буферном растворе или в специальном растворителе. Основной раствор используют для приготовления серийных (2-кратных) разведений антибиотика в питательной среде – бульоне (в объёме 1 мл) или агаре. Из исследуемой бактериальной культуры готовят суспензию стандартной плотности (чаще 103–105 м/о/мл) и засевают по 0,1–0,2 мл на среды с разной концентрацией антибиотика, а также на среду без препарата (контроль культуры). Посевы инкубируют при 37ºС 20–24 ч и более (для медленно растущих бактерий), после чего отмечают результаты опыта по помутнению питательного бульона или появлению видимого роста бактерий на агаре, сравнивая с контролем. Наименьшая концентрация антибиотика, полностью подавляющая рост исследуемой культуры, принимается за МПК.
Метод серийных разведений может быть использован для определения чувствительности к антибиотикам любых микроорганизмов, включая прихотливых и медленно растущих, а также облигатных внутриклеточных паразитов (хламидий, риккетсий и вирусов). В последнем случае антимикробные препараты в различных концентрациях добавляют в среду для культивирования клеток, после чего клетки заражают чистой культурой тестируемого вируса или бактерии. Результат оценивают по ЦПД или с помощью серологических реакций, позволяющих обнаружить накопление антигенов возбудителя в зараженных клетках. Чаще всего с этой целью применяют иммунофлюоресцентный метод (ИФ). Наименьшую концентрацию препарата, препятствующую развитию ЦПД или накоплению в клетках антигенов возбудителя, принимают за МПК.
Интерпретацию результатов, т.е. оценку клинической чувствительности, осуществляют на основании критериев, приведенных в Приложении 2.
Микротест–системы для определения чувствительности
к антимикробным препаратам
Микротест–системы предназначены для быстрого определения клинической чувствительности к антибиотикам бактерий определенных видов или родственных групп. Тестируемые препараты в стандартных концентрациях находятся в лунках готовых пластиковых планшетов. Определяют чувствительность исследуемой культуры к двум концентрациям каждого антибиотика: средней терапевтической и максимальной. Материал из изолированной колонии с помощью мерной бактериологической петли (объем 1 мкл) вносят в 5 мл стандартной питательной среды, содержащей индикатор, и готовят суспензию. Готовую бактериальную суспензию разливают в лунки планшета по 0,1 мл и инкубируют при оптимальных для данного вида бактерий условиях температуры и газового состава среды. О росте бактерий судят по изменению цвета индикатора, что позволяет существенно сократить сроки исследования. Если бактерии сохраняют жизнеспособность в присутствии антибиотика, выделение продуктов метаболизма приводит к изменению цвета индикатора. Отсутствие изменения цвета свидетельствует о полном подавлении жизнедеятельности микроба. Результаты определяют через 4 ч инкубации с помощью спектрофотометра.
Количественное определение чувствительности бактерий
к антимикробным препаратам с помощью Е–теста
Е-тест представляет собой вариант диффузного метода, позволяющий определять МПК антибиотика. Вместо дисков используют стандартные полимерные полоски, приготовленные по специальной технологии (AB BIODISK) и содержащие иммобилизованные антимикробные препараты, нанесенные в виде непрерывного градиента концентрации. На другой стороне полоски Е-теста нанесена шкала значений МПК. При помещении полоски на поверхность агара регулируемый процесс диффузии обеспечивает создание в питательной среде вокруг полоски стабильного градиента концентрации препарата, соответствующего шкале. Процедура определения чувствительности с помощью Е-теста осуществляется аналогично тестированию методом дисков. После инкубации посева вокруг полоски образуется зона задержки роста, имеющая форму эллипса. Значение МПК соответствует месту пересечения эллипсовидной зоны с полоской Е – теста. Для интерпретации результатов (оценки клинической чувствительности) используют стандартные критерии
Рост микроорганизмов в жидкой питательной среде более однообразен. Он сопровождается помутнением среды, образованием плёнки или осадка. Нередко рост микроорганизмов сопровождается появлением запаха, пигментацией среды, выделением газа. Последнее обнаруживают по образованию пены, пузырьков, а также при помощи «поплавков» – маленьких запаянных с одного конца трубочек. Поплавок помещают в пробирку запаянным концом вверх и следят, чтобы он полностью был заполнен средой. В случае выделения газа он скапливается в поплавке в виде пузырька.
Для описания характера роста микроорганизмов в жидких средах их выращивают на мясо-пептонном бульоне или другой среде, обеспечивающей хороший рост.
Бульонные культуры не взбалтывают и наблюдения ведут осторожно, сохраняя их в спокойном состоянии. При наблюдении отмечают:
1) наличие осадка и его свойства (скудный он или обильный, плотный, рыхлый, слизистый или хлопьевидный);
2) наличие плёнки на поверхности и её внешний вид (тонкая, плотная или рыхлая, гладкая или складчатая);
3) наличие и степень помутнения (слабая, умеренная или сильная).
На жидких питательных средах проявляются следующие культуральные свойства микроорганизмов:
- рост с равномерным помутнением жидкой среды характерен для факультативных анаэробов;
- придонный рост с образованием осадка на дне пробирки дают анаэробные микроорганизмы. Образующийся осадок может быть обильным или скудным, крошковидным, гомогенным, волокнистым или в виде крупных хлопьев. По консистенции осадок может быть вязким, слизистым, хрупким или пастообразным;
- пристеночный рост характерен для некоторых бактерий и актиномицетов. В этом случае образуются рыхлые хлопья или компактные зерна, прикрепляющиеся к внутренней поверхности стенок сосуда;
- поверхностным ростом отличаются аэробные микроорганизмы. Они образуют пленку различной плотности и консистенции. Пленка может быть нежной и тонкой, исчезающей при встряхивании пробирки (например, так растут клетки Bacillus subtilis). Для грибов свойственно образование плотной, сухой, кожистой пленки. Она мелко снимается целиком в виде круглого диска, соответствующего диаметру сосуда;
- бульон в присутствии палочковидных форм даёт после взбалтывания волнистость – по бульону как бы пробегают шелковистые нити.
Рост на плотных питательных средах.
На поверхности плотных питательных сред в зависимости от способа посева микроорганизмы могут расти в виде колонии, штриха или сплошного газона. Колонией называют изолированное скопление клеток одного вида, выросшее в большинстве случаев из одной клетки. В зависимости от того, где растут клетки (на поверхности плотной питательной среды, в толще ее или на дне сосуда), различают поверхностные, глубинные и донные колонии. Колонии, выросшие на поверхности среды, отличаются большим разнообразием и, в некоторых случаях, их характерные особенности облегчают идентификацию микроорганизмов. При описании колоний учитывают следующие признаки:
1. величину колонии (диаметр в миллиметрах). Различают точечные колонии (менее 1 мм), мелкие (1–2 мм), средние (2–4 мм) и крупные (4–6 мм и более);
2. форму колонии (округлая, неправильная, амёбовидная, мицелиальная, складчатая, сложная и др.);
3. оптические свойства (отмечают прозрачность, наличие или отсутствие блеска);
4. цвет, обусловленный способностью микроорганизмов синтезировать пигменты. Отмечают цвет колонии и выделение пигмента в среду (следует обратить внимание, что все грязно-белые колонии принято считать бесцветными);
5. поверхность (гладкая, шероховатая, бугристая, складчатая и т.д.). Детально изучить поверхность колонии можно при помощи малого (х10) увеличении микроскопа;
6. профиль колоний (плоский, выпуклый, кратерообразный, каплевидный, конусовидный и др.). Профиль лучше всего определять, глядя сбоку чашки Петри, слегка приоткрыв крышку;
7. край колонии (ровный, волнистый, лопастной, ризоидный и др.). Его оценивают при помощи ручной лупы или малого увеличения микроскопа;
8. структуру колонии (однородная, мелко- или крупнозернистая, волокнистая), которая определяется также при помощи малого увеличения микроскопа;
9. консистенцию колонии можно определить в последнюю очередь при приготовлении мазка, прикасаясь к колонии иглой или петлёй. Различают маслянистую, тестообразную, вязкую, пленчатую, сухую ломкую и др. консистенции.
Приготовить препарат-отпечаток патологического материала. Для чего поверхность исследуемого органа прижечь с помощью прокаленного в пламени спиртовки пинцета. Затем с помощью стерильных скальпеля и пинцета вырезать небольшой кусочек ткани, захватить его пинцетом и несколько раз прикоснуться плоскостью разреза к поверхности предметного стекла. Фиксировать смесью Никифорова (спирто-эфирной смесью 1:1), окрасить по Романовскому-Гимзе, микроскопировать в иммерсионной системе.
Дата добавления: 2015-08-18; просмотров: 339 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая страница | | | следующая страница ==> |
| Приготовление мазка крови, окрашивание по Романовскому-Гимзе | | | ВСТРЕЧА ГОСТЕЙ НА ЖД ВОКЗАЛЕ НИЖНЕГО НОВГОРОДА. |