OR6 OR7

Рисунок 11 - Клетки культур бактерий (х100)

Согласно полученным данным, бактерии пластовых вод представлены как грамотрицательными, так и грамположительными кокками и палочками.

Таблица 1 – Морфологические признаки выделенных микроорганизмов

№	Характеристика	Наличие или отсутствие признака
OR1	OR2	OR3	OR4	OR5	OR6	OR7	OR8
	Морфология клеток, х1300	Палочки	Палочки	Палочки	палочки	палочки	Кокки	кокки	Палочки
	Размер клеток, мкм	2,3*1,3мкм	2,39*1,24мкм	1,51 мкм	1,98 мкм	1,8*1,1 мкм	1,81 мкм	1,79 мкм	1,5 0,8 мкм
	Окраска по Грамму	+	+	+	-	-	+	+	-
	Описание колонии	Неровная граница, поверхность гладкая, широкая блестящая колония белого цвета	Граница не ровная блестящая, бугристая широкая колония белого цвета	Граница не ровная широкая, блестящий белого цвета	Неровная округлая граница, светло-зеленого цвета. Блестит	Граница ровная блестящая бугристая белого цвета	Круглая колония с гладкой границей. Зеленого цвета	Граница гладкая. Блестящая мягкая колония светлого цвета	Граница ровная, широкая блестящая колония белого цвета
	Описание роста на жидкой среде	На поверхности есть тонкая пленка и при встряхиваний виден спиралевидный осадок	На поверхности есть тонкая пленка с густым осадком	Помутнение ровное, на поверхности есть пленка. При встряхиваний виден спиралевидный осадок	Ровное помутнение, при встряхиваний виден спиралевидный рыхлый осадок	Слабое помутнение рыхлый осадок	Густой осадок	Осадок виден только при встряхиваний	Ровное помутнение при встряхиваний виден спиралевидный рыхлый осадок

Как видно из таблицы 1, в пластовых водах месторождения Жетыбай встречались как грамположительные, так и грамположительные виды, по морфологическим признакам – палочки и кокковидные.

На рисунке 12 представлены некоторые колонии выделенных бактерий.

Рисунок 12 – Колонии выделенных бактерий

Культура OR1 была выделена из СКВ 837 в питательной среде МПА. Круглые культуры, с волнистой или гладкой границей, с блестящей поверхностью. Диаметр колоний 8 мм, светло-зеленого цвета. Хорошо растворяется в воде. Граммотрицательные палочки. Размер 2,3*1,3 мкм грамотрицательные палочковидные кокки. В жидкой питательной среде есть тонкая пленка, при встряхиваний образуется рыхлый спиралевидный осадок.

Культура OR2 была выделена из СКВ 2245 в элективной питательной среде Bacillus. Круглые культуры, с волнистой или гладкой границей, с блестящей поверхностью. Диаметр колоний 3 мм, светлого цвета. Хорошо растворяется в воде. Граммотрицательные подвижные палочки размером 2,39*1,24 мкм.

В жидкой питательной среде есть тоная пленка, при встряхиваний образуется рыхлый спиралевидный осадок.

Культура OR3 была выделена из СКВ 837 в элективной питательной среде Bacillus.Круглая колония с гладкой границей, в форме овала, с блестящей поверхностью. Колонии светло зеленого цвета. Объем культуры 1-2мм. Размер клетки 1,51 мкм грамположительные клетки кокки.

Культуры OR4 была выделена из СКВ 837 в питательной среде МПА. Неровная округлая либо волнистая граница, имеет блестящую поверхность. Диаметр колоний 1,0-1,9 мм, цвет: светло-зеленый, хорошо растворяется в воде. Формы клеток в виде кокков, грамположительные подвижные бактерий. Размер клетки 1,98 мкм. В среде МПБ на поверхности образовалась тонкая пленка, при встряхиваний образуется спиралевидный рыхлый осадок.

Культура OR5 была выделена из СКВ 2245 в питательной среде МПА. Круглые культуры, с волнистой или гладкой границей, с блестящей поверхностью. Диаметр колоний 4 мм, светло-желтого цвета. Хорошо растворяется в воде. Через месяц окраска меняется в красно-желтую. Граммотрицательные палочки. Размер 1,8*1,1.

Культуры OR6 была выделена из СКВ 2245 в питательной среде МПА. Круглые культуры, с волнистой или бугристой границей, с блестящей поверхностью. Диаметр колоний 5 мм, светло-зеленого цвета. Хорошо растворяется в воде. Граммотрицательные кокки размером 1,81 мкм.

В жидкой питательной среде есть тоная пленка, при встряхиваний образуется рыхлый спиралевидный осадок.

Культуры OR7 была выделена из СКВ 837 в питательной среде МПА.

Круглая колония с гладкой границей, в форме овала, с блестящей поверхностью. Беловатого цвета. Объем культуры 2-3мм. Размер клетки 1,79 мкм грамположительные клетки кокки. В среде МПБ на поверхности образовалась тонкая пленка, при встряхиваний образуется спиралевидный рыхлый осадок.

Культуры OR8 была выделена из СКВ 2245 в элективной питательной среде Pseudomonas. Круглые культуры, с волнистой или гладкой границей, с блестящей поверхностью. Диаметр колоний 0.2-1 мм, светлого цвета. Хорошо растворяется в воде. Граммотрицательные подвижные палочки размером 1.5*0.8 мкм. В жидкой питательной среде есть тоная пленка, при встряхиваний образуется рыхлый спиралевидный осадок.

Поскольку температурный режим, клеточные включения, а также отношение к кислороду являются одним из важных критериев в современной систематике бактерий, далее был изучен ряд дополнительных признаков выделенных культур (таблица 2 и 3). Рост бактерий изучали при температурах +4°С и +42°С, флуоресцирующие пигменты и включения поли-β-оксибутирата определяли общепринятыми методами.

Таблица 2 – Физиологические признаки выделенных микроорганизмов

№	Характеристика	Наличие или отсутствие признака
OR1	OR2	OR3	OR4	OR5	OR6	OR7	OR8
	Рост при различных температурах: 4º 10º 25º 37º 45º 55º	- - - + + -	- - + + + +	- - - + + +	- - + + + +	- - + + + +	- - + + + +	- - - + + +	- - - + + +
	Оптимум температура, º С	28-37			37-45	28-37	28-37	28-37	28-37
	Отношение к О2	аэробы	Аэробы	аэробы	аэробы	Аэробы	аэробы	Аэробы	Аэробы
	Оптимум рН	6,8-7,4	6,8-7,4	6,8-7,4	6,8-7,4	6,8-7,4	6,8-7,4	6,8-7,4	6,8-7,4
	Кислотоустойчивость	+	+	+	+	+	+	+	+
Примечание: «+» - признак выражен, «-» - признак отсутствуют.

Полученные данные показали, что оптимум температур для культур OR2 и OR3 составляет – 45⁰С, это свидетельствует о том, что культуры относятся к термофильным. Все исследованные культуры были кислотоустойчивыми, оптимум рН составлял – 6,8-7,4.

Далее были исследованы такие важные признаки как подвижность, спорообразование, каталазная и оксидазная активности, способность к проведению денитрификации (Таблица 3).

Таблица 3 – Основные дифференциально-диагностические признаки выделенных бактерий

№ п/п	Культура	Окраска по Грамму	Подвижность	Споры	Наличие каталазы	Наличие оксидазы	Денитрификация	Гидролиз крахмала	Гидролиз желатины	Гидролиз липидов

Продолжение таблицы 3

	OR1	-	+	-	+	+	+	++	-	-
	OR2	+	-	-	+	+	-	+	+	+
	OR3	+	+	+	+	+	+	+++	+++	+
	OR4	-	+	+	+	+	+	++	+++	+
	OR5	-	+	-	+	+	+	+	-	-
	OR6	+	-	-	+	+	-	+	++	+
	OR7	+	+	+	+	+	+	+++	++	+
	OR8	-	+	-	+	+	+	+++	+	+
Примечание: -- признак отсутствует +-признак выражен ++признак хорошо выражен +++ - признак отлично выражен

Как показано в таблице, OR1, OR5 и OR8 штаммы грамотрицательные, а остальные грамположительные микроорганизмы. Все кроме OR2 и OR6 подвижные бактерии. OR3, OR4, OR7 спорообразующие штаммы. Все изученные бактерии обладают каталазными и оксидазными активностями. Все кроме OR1 и OR4 штаммов способны к гидролизу липидов. Определено, что все бактерии, кроме OR3 и OR6 штаммовспособны к денитрификации.

Как известно, разжижение желатины определяют визуально, при разжижении среда мясопептонной желатины становится жидкой и меняется в цвете (рисунок 13).

OR5

OR7

Рисунок 13 - Исследование разжижения желатины

При определении амилолитической активности, среда, содержащая крахмал, окрашивается в синий цвет, а зона гидролиза остается бесцветной или приобретает красно-бурую окраску, если крахмал гидролизовался до декстринов (рисунок 14).

Рисунок 14 - Изучение амилолитической активности

Для дальнейшей идентификации видовой принадлежности микроорганизмов была изучена способность бактерий к ассимиляции отдельных органических веществ, причем, по данным Пикета и Гринвуда, для этих целей может быть использована способность бактерий подкислять или подщелачивать среду при росте на некоторых субстратах [31].

Из данных, представленных в таблице 4, видно, что для выделенных культур характерно использование широкого круга веществ в качестве источника углерода. Полученные результаты позволили идентифицировать изучаемые культуры. Так, растущий при температуре 42⁰С, не содержащий аргининдигидролазу и не ассимилирующий ксилозу штамм OR8 был отнесен к виду Pseudomonas stutzeri OR8. Культура на среде с D,L-аргинином подщелачивала среду, на среде с арабинозой подкисляла ее, не усваивала мальтозу и ксилозу, что также характерно для этого вида.

Таблица 4 - Усвоение различных источников углерода бактериями

Штаммы	глюкоза	Фруктоза	мальтоза	ксило за	арабиноза	L-серин	L-аргинин	L-пролин	L-валин
OR1	к,г	к, г	к, г	б/и	б/и	щ	б/и	щ	щ
OR2	К	к	к	к, г	к	б/и	щ	щ	щ
OR3	К	щ	б/и	б/и	к	б/и	щ	щ	б/и
OR4	К	к	б/и	к, г	К	щ	щ	щ	щ

Продолжение таблицы 4

OR5	б/и	б/и	б/и	б/и	б/и	к	к	к	К
OR6	К	к	щ	б/и	б/и	щ	щ	щ	щ
OR7	К	к	к	к, г	к	щ	щ	щ	щ
OR8	К	к	б/и	б/и	к	б/и	щ	щ	щ
Примечание - к – кислота, г – газ, щ – щелочь, б/и – без изменений.

Штаммы OR3, OR4 и OR7 по образованию споры, окраске по Граму и другим физиолого-биохимическим признакам отнесены к роду Bacillus spp.

Штаммы OR1 и OR2 на основании морфологических и биохимических особенностей были отнесены к роду Pseudomonas spp.

По результатам изучения физиолого-биохимических признаков штамм OR5 способный подщелачивать среду с мальтозой, и не ассимилирующий ксилозу и арабинозу отнесен к роду Alcaligenes sp. OR5.

Штаммы OR6 и OR2 при росте на углеводах не образовали газа, а также по другим отличительным характеристикам отнесены к роду Micrococcus spp.

Заключение

В рамках исследования пластовых вод СКВ 837 и СКВ 2245, для определения типов микроорганизмов нефтяного пласта использованы различные элективные питательные среды, определены физико- биохимические свойства этих микроорганизмов

Таким образом, проведённые нами исследования позволили установить следующие выводы:

1) Из 2 проб пластовых вод месторождения Жетыбай были выделены 8 культур микроорганизмов и условно названы как: OR1, OR2, OR3, OR4, OR5, OR6, OR7, OR8.

2) Изучены морфолого-культуральные и физиолого-биохимические признаки выделенных бактерий.

3) Показано, что при экстремальных условия нефтепласта встречаются как грамположительные, так и грамположительные виды, по морфологическим признакам – палочки и кокковидные виды бактерий.

4) Установлено, что штаммы OR3, OR4 и OR7 принадлежат роду Bacillus spp., штамм OR1 и OR4– роду Pseudomonas spp., штамм OR5 – роду Alcaligenes sp., штаммы OR2 и OR6 – роду Micrococcus spp.

Пoставленные задачи исследoвания выпoлнены пoлнoстью.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Пластовые воды нефтяных и газовых месторождений, 2014.

URL: http://www.geolib.net/oilgasgeology/plastovye-vody-neftyanyh gazovyh-mestorozhdeniy.html

2. Сухарев Г. М. «Гидрогеология нефтяных и газовых месторождений» - М., «Недра» 1971 год.

3. Мacкeт М. Физичecкиe ocнoвы тeхнoлoгии дoбычи нeфти. Ижeвcк: ИКИ, Моcквa-Ижeвcк: Инcтитут компьютeрных иccлeдовaний, 2003, 376 c.

4. Желтов Ю.П. «Разработка нефтяных месторождений» М. Недра, 1986.

5. Сургучев М.Л., «Вторичные и третичные методы увеличения нефтеотдачи пластов» — М.: Недра, 1985. — 308 с.

6. Назина Т. Н. «Микроорганизмы нефтяных пластов и использование их в биотехнологии повышения нефтеотдачи»: М., 2000. –167 c.

7. Zobell C.E. Bacterial Release of Oil From Sedimentary Materias / Oil and Gaz J.-Vol.43.2000g -№ 13. –Р. 62-65

8. А.Логвиненко, А.Пан. Микробиологические методы повышения нефтеотдачи.2012 г.

9. Зайцева М. Микробиологические МУН. Актуальность их применения на месторождениях Филиала «Муравленковскнефть» Статья Газпром нефть – C.30.

10. Бирштехер Э. Нефтяная микробиология – 1957.

11. Микробиологическая депарафинизация нефтяных скважин.,- 2010. URL: http://old.nauka.kz/biol_med/razd4/mikrobiolog_deparafinazacia.php

12. Овсянникова В.С «Влияние микробиологического воздействия на углеводородный состав нефтей при увеличении нефтеотдачи пластов нефтевытесняющими композициями с регулируемой щелочностью»

13. Хисамов Р.С. «Увеличение охвата продуктивных пластов воздействием»

14. Eрeмин Н.A., Ибaтулин Р.Р., Нaзинa Т.Н., Cитников A.A. Биомeтоды увeличeния нeфтeотдaчи. Моcквa., 2003. 12-13C

15. Розанова Е.П., Назина Т.Н. Углеводородокисляющие бактерии и их активность в нефтяных пластах. // Микробиология. 1982. Т. 51.

16. Назина Т.Н., Розанова Е.П. Термофильные сульфатвосстанавливающие бактерии из нефтяных пластов. // Микробиология. 1978. Т. 47.

17. Назина Т.Н. Микроорганизмы нефтяных пластов и использование их в биотехнологии повышения нефтеотдачи. Дис. докт. биол. Наук. М.:2000

18. Назина Т.Н., Иванова А.Е., Благов А.В. Микробиологическая характеристика нефтяных месторождений полуострова Мангышлак. // Микробиология. М. 1992. Т.61

19. Ганиткевич Я.В. Поверхностно-активные вещества микробного происхождения//Б иотехнология. 1988.

20. Турова. Т Н Назина Т Н, Полтараус А Б, Осипов Г А Филогенетическое положение и хемотаксономические характеристики сульфатвосстанавливающих бактерий рода Desulfomicrobium // Микробиология. - 67,6. - 1998.

21. Еремин. Н.А. Моделирование месторождений нефти методами нечеткой логики.- М., ГАНГ им. И.М. Губкина, 1995., 397

22. Ибатуллин P.P., Хисамов Р.С., Беляев С.С., Борзенков И.А., Назина Т.Н. Разработка и применение микробных биотехнологий увеличения нефтеотдачи пластов. // Нефтяное хозяйство. 2003.

23. Слободкин А.И., Заварзина Д.Г., Соколова Т.Г., Бонч-Осмоловская Е.А. Диссимиляционное восстановление неорганических акцепторов электроновтермофильными анаэробными прокариотами. // Микробиология. 1999.

24. Осипов Г.А., Назина Т.Н., Иванова А.Е. Изучение видового состава микробного сообщества заводняемого нефтяного пласта методом хромато-масс-спектрометрии. // Микробиология. 1994

25. Юлбaриcов Э. М. Биогeотeхнология увeличeния нeфтeотдaчи / Э. М. Юлбaриcов // Интeрвaл. Октябрь-ноябрь – 1999. – № 9, 10. – C. 4-9

26. Кузнeцовa E.A. Учeбно-мeтодичecкоe поcобиe «Микробиология» Орeл: ОрeлГТУ, 2005г- 250c.

27. Гусев М. В., Минеева Л. А.Микрoбиoлoгия: Учебник для студ. биoл. специальнoстей вузoв.— 4-е изд., стер.— М.: Издательский центр «Академия», 2003. — 464 с.

28. Лысак В. В Микрoбиoлoгия: учебнoе пoсoбие. — Минск: БГУ, 2007

29. Обзор cоврeмeнных мeтодов повышeния нeфтeотдaчи плacтa // НИК Пeтроc. – 2010. URL: http://petros.ru/worldmarketoil/?action=show&id=267.

30. Нeтруcовa A.И. Прaктикум по микробтологии. Моcквa ACADEMA 2005г. 129 c.

31. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. – Киев: Наукова думка, 1990. – 264 с

32. Лeринa И.В., Пeдeнко A.И. Руководcтво к лaборaторным зaнятиям по микробиологии. –М.: Экономикa, 1980. -150 c.

33. Лeринa И.В., Пeдeнко A.И. Лaборaторныe рaботы по микробиологии. –М.: Экономикa, 1986. -128 c.

Дата добавления: 2015-08-03