Производство витаминов.

Витамины – незаменимые органические соединения различной химической природы, необходимые любому организму в малых концентрациях и выполняющих в нем каталитические и регуляторные функции. Витамины не образуются гетеротрофы, и лишь автотрофы способны синтезировать витамины, в частности растения. Многие микроорганизмы образуют редкие витамины, поэтому синтез витаминов с помощью микроорганизмов стал основной для разработки технологий промышленного производства.

Однако с помощью энзимов целесообразнее производить лишь особо сложные по строению витамины: В₂, B₁₂, β-каротин (провитамин А) и предшественники витамина D. Осталь­ные витамины либо выделяют из природных источников, либо синтезируют химическим путем.

Витамины (от латинского vita – жизнь) это группа низкомолекулярных органических веществ, различной химической природы, необходимых любому организму в ничтожных концентрациях и выполняющих в нем каталитические и регуляторные функции. Недостаток того или иного витамина нарушает обмен веществ и нормальные процессы жизнедеятельности организма, приводя к развитию патологических состояний.

Организм человека и животных не синтезирует витамины или синтезирует в недостаточном количестве и поэтому должен получать их в готовом виде с пищей. Витамины обладают исключительно высокой биологической активностью и требуются организму в очень небольших количествах: от нескольких микрограммов до нескольких миллиграммов в день. Большинство витаминов являются коферментами или их предшественниками и участвуют в многочисленных ферментативных реакциях.

В природе источником витаминов являются растения и микроорганизмы. Менахиноны и кобаламины синтезируются исключительно микроорганизмами. И хотя химический синтез в производстве большей части витаминов занимает ведущее положение, микробиологические методы также имеют большое практическое значение.

К водорастворимым витаминам относят: витамин С, витамины группы В (тиамин или витамин В₁, рибофлавин или витамин В₂ , витамины В₆, В₁₂), пантотеновую кислоту и биотин. К жирорастворимым витаминам относятся витамины А, D, E.

Благодаря изучению физиологии и генетики микроорганизмов — продуцентов витаминов и выяснению путей биосинтеза каждого из них создана теоретическая основа для получения микробиологи­ческим способом практически всех известных в настоящее время витаминов. Витамины используются в качестве лечебных препаратов, для создания сбалансированных пищевых и кормовых рационов и для интенсификации биотехнологических процессов.

Витамины группы В Получение витамина В2 (рибофлавин).

Одна тонна моркови содержит один грамм В2, одна тонна печени содержит шесть грамм, гриб Eremothecium ashbyii продуцирует 25 кг.

В качестве посевного материала используют споры гриба, выращенного на пептоне (7-8 дней при t = 29-30ºС). После стерилизации жидкий посевной материал идет в ферментер (время – 3 суток при температуре 28-30ºС концентрация В2 = 1,4 мг/мл). После ферментера культуральную жидкость концентрируют в вакууме, сушат на распылительной сушилке и смешивают с наполнителем. При использовании рекомбинантного штамма можно синтезировать втрое больше продукта за 40 часов ферментации

Сверхсинтеза рибофлавина добиваются действием на дикие штаммы мутагенов, нарушающих механизм ретроингибирования синтеза витамина В₂ флавиновыми нуклеотидами, а также изменением состава культуральной среды. Отбор мутантов ведут по устойчивости к аналогу витамина В₂ — розеофлавину..

При подготовке инокулята гриб пересевают последовательно по схеме: посев на скошенную агаризованную среду в пробирке на жидкую среду, в колбы с нарастающим объемом, в инокулятор.

В состав среды для роста продуцентов витамина В₂ входят достаточно сложные органические вещества — соевая мука, кукурузный экстракт, сахароза, карбонат кальция, хлорид натрия, гидрофосфат калия, витамины, технический жир. Грибы весьма чувствительны к изменению состава среды и подвержены инфи­цированию. Перед подачей в ферментер среду подвергают стерилизации, добавляя к ней антибиотики и антисептики. Подготавливают жидкую питательную среду и посевной материал культуры дрожжей в разных емкостях — ферментере и посевном аппарате.

Культивирование в ферментере ведут до начала лизиса клеток и появления спор (определяют микроскопически). Температура культивирования 28—30 °С, давление воздуха в ферментере (1—2) • 10⁴ Па, расход воздуха 1,5—2,0 л в минуту на 1 л культуральной жидкости. Выход рибофлавина около 1200 мкг/мл.

Для получения кормового препарата рибофлавина культуральную жидкость упаривают под вакуумом до содержания 30—40% сухих веществ. Сироп высушивают в распылительной сушилке, сухую пленку дробят в дробилке до состояния порошка, который расфасовывают.

Очень важна хорошая обеспеченность флавинами кормов животных и птиц. Комбикорма должны содержать 5—6 г. рибофлавина на тонну. Добавки витамина В₂ в корма обеспечивают нормальный рост животных, высокую яйценоскость кур и выживаемость цыплят.

Витамин В₁₂ Витамин В₁₂ открыт в 1948 г. одновременно в США и Англии. В 1972 г. в Гарвардском университете был осуществлен химический синтез корриноидного предшественника витамина B₁₂. Химический синтез корнестерона — структурного элемента корринового кольца витамина, включающий 37 стадий, в крупных масштабах не воспроизведен из-за сложности процесса.

Витамин B₁₂ регулирует углеводный и липидный обмен, участвует в метаболизме незаменимых аминокислот, пуриновых и пиримидиновых оснований, стимулирует образование предшественников гемоглобина в костном мозге; применяется в медицине для лечения злокачественной анемии, лучевой болезни, заболеваний печени, полиневрита и т. п. Первоначально витамин B₁₂ получали исключительно из природного сырья, но из 1 т печени можно было выделить всего лишь 15 мг витамина. Единственный способ его получения в настоящее время — микробиологический синтез.

В природе витамин В₁₂ и родственные корринойдные соединения находят в клетках микроорганизмов, в тканях животных и некоторых высших растениях (горох, лотос, побеги бамбука, листья и стручки фасоли). Однако происхождение витамина В ₁₂ в высших растениях окончательно не установлено. Такие низшие эукариоты, как дрожжи мицелиальные грибы, корринойды, по-видимому, не образуют. Организм животных не способен к самостоятельному синтезу витамина. Среди прокариот способность к биосинтезу корринойдов широка распространена. Активно продуцируют витамин B₁₂ представители рода Propionibacterium. Природные штаммы пропионовокислых бактерий образуют 1,0-8,5 мг/л корринойдов, но получен мутант P. shermanii M-82, с помощью которого получают до 85мг/л витамина.

Истинный витамин B₁₂ в значительных количествах синтезирует Nokardia rugosa. Путем мутации и отбора получен штамм Nokardia rugosa, накапливающий до 18 мг/л витамина В_!2.

Активные продуценты витамина обнаружены среди представителей рода Micromonospora: M. eshinospora, M. halophitica, M.fusca M. chalceae. Высокой кабаламинсинтезирующей активностью обладают метаногенные бактерии, например Methanosarcina barkeri, M. vacuolata и отдельные штаммы галофильного вида Methanococcus halophilus.

В нашей стране в качестве продуцента витамина В₁₂ используют Рropionobacterium freudenreichii var. shermaniil

Для получения витамина В₁₂ бактерии культивируют периодическим методом в анаэробных условиях в среде, содержащей кукурузный экстракт, глюкозу, соли кобальта и сульфата аммония. Образующиеся в процессе брожения кислоты нейтрализуют раствором щелочи, которая непрерывно поступает в ферментер. Через 72 ч в среду вносят предшественник - 5,6-ДМБ. Без искусственного введения 5,6-ДМБ бактерии синтезируют фактор В и псевдовитамин В₁₂ (азотистым основанием служит аденин), не имеющие клинического значения.

Бактерии плохо переносят перемешивание. Применение уплотняющих агентов (агар, крахмал), предотвращающих оседание бактерий, а также использование высокоанаэробных условий и автоматического поддержания рН позволяет получить наиболее высокий выход витамина — 58 мг/л. Ферментацию заканчивают через 72 ч. Витамин сохраняется в клетках бактерий. Поэтому после брожения биомассу сепарируют и экстрагируют из нее витамин водой, подкисленной до рН 4,5 - 5,0 при 85 - 90° С в течении 60 мин с добавлением в качестве стабилизатора 0,25%-ной NaNO₂.

При получении Ко-В₁₂ стабилизатор не добавляют. Водный раствор витамина охлаждают, доводят рН до 6,8 - 7,0 50%-ным раствором NaOH. К нему добавляют A1₂(SO4)3*18H₂O и безводный FeCl₃ для коагуляции белков и фильтруют через фильтр-пресс.

Очистку раствора проводят ионообменной смоле СГ-1, с которой кобаламины элюируют раствором аммиака. Далее проводят дополнительную очистку водного раствора витамина органическими растворителями, упаривание и очистку на колонке с А1₂О₃. С окиси алюминия кобаламины элюируют водным ацетоном. При этом К0-В₁₂ может быть отделен от CN- оксикобаламина.

К водно-ацетоновому раствору витамина добавляют ацетон и выдерживают при 3 - 4° С 24 - 48 ч. Выпадающие кристаллы витамина отфильтровывают, промывают сухим ацетоном и серным эфиром и сушат в вакуум - эксикаторе. Для предотвращения разложения Ко-В₁₂ все операции необходимо проводить в сильно затемненных помещениях или при красном свете.

Для химической очистки витамина B₁₂ используется его способность образовывать аддукты с фенолом и резорцином. При этом способе отделения витамина от сопутствующих ему факторов упрощается. Промышленный концентрат цианкобаламина обрабатывают водным раствором резорцина (или фенола), выделяют комплекс витамина В_]2 с резорцином (или фенолом), далее разлагают его и получают кристаллический препарат.

В процессе получения витамина B₁₂ с помощью пропионовокислых бактерий применяют дорогостоящую антикоррозийную аппаратуру, сложные и дорогие питательные среды. Усовершенствование технологического процесса идет в направлении удешевления компонентов питательных сред (замена глюкозы сульфитными щелоками) и перехода с периодического культивирования на непрерывный процесс.

Витамин А и ß- каротин. Важное место в обмене веществ у животных занимает ß -каротин, который в печени превращается в витамин А (ретинол). В организме человека и животных каротины не образуются. Установлено, что многие микроорганизмы - фототрофные бактерии, актиномицеты, плесневые грибы, дрожжи — синтезируют каротин. Характерно, что содержание ß -каротина у микроорганизмов во много раз превышает содержание этого провитамина у растений. Так, в 1 г моркови присутствует всего 60 мкг ß -каротина, в то время как в 1 г биомассы гриба Blaneslea trispora — 38 тыс. мкг. Разработаны опытные установки как периодического, так и непрерывного действия для синтеза р-каротина, основной недостаток которых — высокая стоимость сырья и большая длительность процесса.

Витамин А (ретинол). Основными источниками витамина А служат яйца, сливки, сметана, коровье молоко, сливочное масло, почки и печень крупного рогатого скота, печень некоторых рыб и морских животных: трески, палтуса, акулы, кита, тюленя и др. Суточная потребность человека в витамине А составляет 2,5 мг.

Витамин А в высших растениях и микроорганизмах не синтезируется, но у них образуется его предшественники - каротиноиды. Структурные изомеры каротина способны превращаться в организме человека и животных в витамин А в результате расщепления в печени и слизистой оболочке кишечника.

Каротиноиды — наиболее многочисленная и широко распространенная группа природных ферментов. Их образуют высшие растения, водоросли (хлорелла), бактерии. Кроме того, каротиноиды синтезируют некоторые мицелиальные грибы и дрожжи. Изомерные формы каротиноидов обладают различной А-витаминной активностью.

Каротиноиды получают с помощью химического синтеза и путем выделения из природных источников – растений и микроорганизмов. Химическим путем получают b-каротин, витамин А и ряд других каротиноидов, синтез которых осуществляется в заводских масштабах.

Из растительных материалов каротиноиды могут быть выделены экстракцией органическими растворителями, не содержащими пероксидов, на рассеянном свету в инертной атмосфере с последующим омылением и хроматографическим разделением. Перед экстрагированием биомасса гомогенизируется при охлаждении. Процесс проводят в темноте в присутствии антиоксидантов. Для извлечения пигментов используют полярные растворители, например ацетон или метанол. Далее каротиноиды переводят в неполярные растворители, такие как гексан или петролейный эфир. Индивидуальные пигменты получают путем хроматографирования в тонком слое силикагеля или алюминия.Впервые каротиноиды были выделены из стручков перца, позже – из желтой репы и моркови Daucus carota, откуда и получили свое название.

Каротиноиды получают с помощью химического синтеза и путем выделения из природных источников – растений и микроорганизмов. Традиционными источниками получения каротиноидов служат морковь, тыква, шиповник, облепиха и др. Наряду с этим все шире в тех же целях используют мицелиальные грибы и дрожжи. Как продуценты каротиноидов представляют интерес бактерии и водоросли.

Перспективными в данном направлении являются некоторые фототрофные бактерии, у которых можно регулировать выход каротиноидов. Биомассу пурпурных бактерий, богатую каротиноидами в Японии используют в качестве добавок в рацион кур, что способствует более интенсивному окрашиванию желтка.

Продуцентами b-каротина, широко применяемыми для промышленного получения этого пигмента, являются мукоровые грибы Blakeslea trispora и Choanephora conjuncta. При совместном культивировании разнополых штаммов этих грибов на специально подобранных средах выход каротина составляет около 3 – 4 г/л среды.

Среда содержит растительные масла, керосин, поверхностно-активные вещества и некоторые специальные стимуляторы. В последние годы в целях экономии для получения b-каротина начали применять вторичные продукты отхода – кукурузный экстракт и гидрол. В качестве стимуляторов синтеза каротина используют цитрусовую пульпу и мелассу, а также циклогексан.

Процесс получения бета-каротина при использовании В. trispora многостадиен. На первом этапе выращивают отдельно положительные и отрицательные штаммы гриба. Следующий этап – совместное выращивание разнополых штаммов в ферментаторе при 26 ⁰С и достаточно интенсивной аэрации. На третьей стадии выращивания смешанную культуру вносят в большой ферментатор и инкубируют ее в течение 6-7 сут при той же температуре и аэрации. При использовании соответствующих стимуляторов можно как увеличивать выход продукта, так и изменять его состав.

Исследования получения каротиноидов продолжаются. На сегодняшний день показано, что удешевить процесс можно за счет использования отходов, остающихся при производстве целлюлозных материалов. Установлено, что синтез каротиноидов увеличивается почти в 7 раз, ели источником углерода в среде будет целлобиоза.

Каротиноиды широко применяются в сельском хозяйстве, медицине и пищевой промышленности. b-Каротин используют главным образом в пищевой промышленности, а также при изготовлении лекарств и косметических средств.

Дата добавления: 2015-07-15