Ферменты используемые в биохимии для решения вопросов болезни Альцгеймера и шизофрении(аутизма на основе связи релин-дофамин)способы получения.

Относительно рилина:

Существуют белки активизирующие и дезактивизирующие выработку рилина (его регуляцией занимается транкрипционный фактор TBR1),как в случае с шапероном.Активизирующий и повышающий уровень м-РНК рилина и GAD67(фермента преобразующий глутамат>ГАМК-вальпроевая кислота,как было отсечено выше понижение выработки глутамата повышает выработку

дофамина,соответственно L-метионина).Дезактивизирующий фактор рилина,либо влечет собой понижение фенотипической эксперсии, L-метионин, при этом наблюдаются одновременные всплески эксперсии DNMT1,ДНК-метилтрансферазы

(донором метильных групп является S-аденозил-метионин)

Рис. 8 (вверху неактивный нейрон без эксперсии релина с присутствием L-метионина, внизу активные нейроны с активацией рилина)

Способ получения hsp-70,белка теплового шока:

Очистка нековалентно связанных, продуцируемых клеткой комплексов hsp70-пептид была описана ранее, см., например, Udono et al., 1993, J. Exp. Med. 178: 1391-1396. Представленный в качестве

Log inпримера способ, который может быть использован, но без ограничения, заключается в следующем.

Сначала клетки человека или млекопитающего суспендируют в 3 объемах буфера для лизиса 1Х,

Sign up состоящего из 5 мМ натрий фосфатного буфера (pH 7), 150 мМ NaCl, 2 мМ CaCl2, 2 мМ MgCl2 и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF). Затем осадок обрабатывают ультразвуком на льду до тех пор, пока 99% клеток не будет подвергнуто лизису, что устанавливают при микроскопическом исследовании. Как альтернатива разрушению ультразвуком, клетки можно лизировать механическим фрагментированием и при таком подходе клетки обычно повторно суспендируют в 30 мМ бикарбонате натрия (pH 7,5), 1 мМ PMSF, инкубируют на льду в течение 20 минут и затем гомогенизируют в гомогенизаторе Dounce до тех пор, пока >95% клеток не будет подвергнуто лизису. Затем лизат центрифугируют при 1000 g в течение 10 минут, чтобы удалить неразрушенные клетки, ядра и другой клеточный дебрис. Полученный супернатант повторно центрифугируют при 100000 g в течение 90 минут, супернатант собирают и затем смешивают с Con A Sepharose™, уравновешенной забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS), содержащим 2 мМ Ca2+ и 2 мМ Mg2+. Когда клетки лизируют механической фрагментацией, супернатант разводят равным объемом буфера для лизиса 2Х до смешивания с Con A Sepharose™. Затем супернатант оставляют для связывания с Con A Sepharose™ в течение 2-3 часов при 4°С. Материал, который не удалось связать, собирают и диализуют в течение 36 часов (три раза, 100 объемов каждый раз) против 10 мМ трис-ацетата (pH 7,5), 0,1 мМ EDTA, 10 мМ NaCl, 1 мМ PMSF. Затем диализат центрифугируют при 17000 оборотов в минуту (ротор Sorvall SS34) в течение 20 минут. Затем полученный супернатант собирают и наносят на ионообменную хроматографическую колонку Mono Q FPLC™ (Pharmacia), уравновешенную 20 мМ трис-ацетатом (рН 7,5), 20 мМ NaCl, 0,1 мМ EDTA и 15 мМ 2-меркаптоэтанолом. Затем колонку обрабатывают градиентом от 20 мМ до 500 мМ NaCl и затем элюированные фракции фракционируют с помощью гелевого электрофореза в полиакриламине в присутствии додецилсульфата натрия (SDSPAGE) и характеризуют с помощью иммуноблоттинга, используя подходящие анти-hsp70-антитела (например, из клона N27F3-4 от StressGen).Фракции, проявляющие сильную иммунореактивность с анти-hsp70-антителами, объединяют и комплексы hsp70-пептид осаждают сульфатом аммония; точнее фракцией 50-70% насыщения сульфатом аммония. Полученный осадок затем собирают центрифугированием при 17000 оборотов в минуту (ротор Sorvall SS34) и промывают 70% сульфатом аммония. Промытый осадок затем растворяют и любой остаточный сульфат аммония удаляют гельфильтрацией на колонке с сефадексомR G-25 (Pharmacia). Если необходимо, полученный таким образом препарат hsp70 можно повторно очистить на ионообменной хроматографической колонке Mono Q FPLC™ (Pharmacia), как описано выше.

Комплекс hsp70-пептид можно очистить до явной гомогенности, используя описанный способ. Обычно 1 мг комплекса hsp70-пептид можно выделить из 1 г клеток/ткани.

Улучшенный способ выделения комплексов hsp70-пептид включает контактирование клеточных белков с АДФ или негидролизуемым аналогом АТФ, прикрепленным к твердому субстрату, с тем чтобы hsp70 в лизате мог связываться с АДФ или негидролизуемым аналогом АТФ, и элюирование связанного hsp70. В предпочтительном способе используют колоночную хроматографию с АДФ, прикрепленным к твердому субстрату (например, АДФ-агароза). Полученные препараты hsp70 характеризуются более высокой чистотой и отсутствием загрязняющих пептидов. Выходы комплекса hsp70 также оказываются значительно увеличенными, приблизительно в 10 раз. Альтернативно хроматография с негидролизуемыми аналогами АТФ, вместо АДФ, можно использовать для очистки комплексов hsp70-пептид. В качестве примера, но без ограничения, очистку комплексов hsp70-пептид хроматографией на АДФ-агарозе можно проводить следующим образом.

Клетки саркомы Meth A (500 миллион клеток) гомогенизируют в гипотоническом буфере и лизат центрифугируют при 100000 g в течение 90 минут при 4°С. Супернатант наносят на колонку с АДФагарозой. Колонку промывают буфером и элюируют 5 колоночными объемами 3 мМ АДФ. Комплексы hsp70-пептид элюируются во фракциях с 2 по 10 из общих 15 фракций, которые элюируются. Элюированные фракции исследуют с помощью SDS-PAGE. Комплексы hsp70-пептид можно очищать до явной гомогенности, используя описанный способ.

Выделение HSP из комплекса hsp70-пептид можно проводить в присутствии АТФ или при низком pH. Указанные оба способа можно использовать, чтобы элюировать пептид из комплекса hsp70-пептид. Первый подход включает инкубацию препарата комплекса hsp70-пептид в присутствии АТФ. Другой подход включает инкубацию препарата комплекса hsp70-пептид в буфере с низким pH. Описанные способы и любые другие способы, известные в данной области, можно применять, чтобы выделить HSP и пептид из комплекса hsp-пептид.

Вальпроевая кислота.Торговые названия вальпроевой кислоты:

1. Апилепсин

2. Депакин

3. Орфирил

4. Конвулекс

5. Энкорат

Лекарственные формы:

1.Таблетки

2.Кишечнорастворимы таблетки и капсулы, по 150,200,300 и 500 мг.

3.Сироп 5% и 30% раствор для приема внутрь во флаконах по 60 мл.

4.Лиофилизированный порошок для инъекций по 400 мг.

Способ применения:

1.Перрорально

2.Внутривенно(струйно или капельно)

Теперь моей основной задачей является проверка вышеперечисленных способов эмпирически,используя биохимическую аппаратуру и теоретическую часть, выводы научного исследования будут опубликованы в следующей статье,а также будут затронуты вопросы касаемые феноменов аутизма, и будут даны на них ответы,к примеру причина гениальности Эйнштейна на генном уровне, т.к. автор данной статьи является представителем спектра аутизма.

1.Альбертс Б., Брей Д.,Льюис Дж. и др. Молекулярная биология в 3-х томах. – М.: Мир, 1994.- 1558 с.

2. Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика:В 3 т. М.: Мир 1987-1988. Т. 1. 295 c. Т. 2. 368 c. Т 3 335 c.

3.Инге-Вкчтомов С.В. Генетика с основами селекции.М., Высная школа 1989.

1.Alberts B., Bray D., LewisJ..Et al. Molecular Biology of the Cell in 3 volumes. –M.: World, 1994-1558 s.

2. Ayala, F.., J.Kayger. Modern genetics: in 3 volumes.: Mir, 1987-1988. T. 1. 295 S. T.2 368 S. T. 3 335 S.

3. Inge-Vechtomov S.V. Genetics with the basics of selection. MA, Graduate School, 1989.

5)

Дата добавления: 2015-07-15