Биологическое значение метилирования ДНК

3.1 Импринтинг: общебиологический аспект

При импринтинге специфический характер дифференциальной активности генов определяется полом организма, от которого эти гены унаследованы. У некоторых насекомых, например, грибных комариков, весь набор отцовских хромосом элиминируется во время сперматогенеза. У этих организмов отцовские хромосомы маркируются в цитоплазме клеток зародышевой линии, удаляются при созревании гамет и не передают свои гены следующему поколению.

У млекопитающих и высших цветковых растений отцовские и материнские гены оказывают разный эффект на развитие эмбриона, но в одинаковой степени представлены в гаметах, образующихся в результате мейоза. В этом случае вклады отцовского и материнского геномов в развитие организмов не эквивалентны и происходит видимое искажение менделевских правил наследования некоторых признаков. Иными словами, характер экспрессии отцовского и материнского аллелей одного и того же гена в организме-потомке может быть различным, так как зависит от их происхождения. Молекулярные механизмы этого явления в настоящее время до конца непонятны. Предполагается, что в развитие феномена импринтинга вносят вклад зависимые от пола модификации ДНК определенных генов, в частности метилирование их регуляторных участков.

Импринтинг распространяется на узкую группу (более 20) генов млекопитающих, отличающихся от большинства генов тем, что их аллели функционально неравноценны. Обычно копии того или иного гена либо обе не работают, либо равно активны. В случае импринтированных генов активен только один аллель (отцовский или материнский), причем статус строго детерминирован именно происхождением (от какой из родительских клеток). Не все импринтированные гены идентифицированы в функциональном отношении: установлено, однако, что большинство из них обеспечивает развитие зародыша. Дифференциальная активность аллелей импринтированных генов обусловлена различиями в метилировании регуляторных последовательностей этих генов - энхансеров и сайленсеров, обладающих противоположными функциями. Первые трансактивируют прилежащие гены, тогда как вторые, напротив, подавляют их активность. Результатом метилирования регуляторных последовательностей становится инвертирование их функций - энхансеры перестают активировать гены, а сайленсеры - их подавлять. Мозаика метилированных и неметилированных (интактных) регуляторных последовательностей определяет импринтированное состояние гена. В клетках с мутантной ДНК-метилтрансферазой различия в профиле метилирования импринтированных генов сглаживаются и соответственно исчезают различия в их активности.

3.2 Регуляция метилирования ДНК в эукариотических клетках

В эукариотических клетках описаны два типа процессов нормального метилирования. Первый, это de novo метилирование, отвечающее за перераспределение метилирования во время эмбриогенеза и процессов дифференцировки, проходящих во взрослом организме. Недавно были описаны две человеческие метилтрансферазы Dnmt13a и Dnmt3b, обладающие de novo метилирующей активностью. Гомологичные гены были обнаружены у мыши. Эксперименты по выключению этих генов показали, что и Dnmt3a и Dnmt3b абсолютно необходимы для de novo метилирующей активности, но не имеют эффекта на поддерживающее метилирование.

Второй тип метилирующей активности в эукариотических клетках называется поддерживающим метилированием и отвечает за сохранение уже имеющегося паттерна метилирования. Первоначально была описана мышиная поддерживающая метилтрансфераза Dnmt1. Высоко гомологичные ферменты были обнаружены у человека и курицы. Функциональные исследования этого фермента показали, что поддерживающее метилирование жизненно необходимо для нормального эмбрионального развития мыши. Полный гомозиготный нокаут нок-аут мышиной метилтрансферазы Dnmt1 приводит к развитию нежизнеспособного эмбриона. В процессе репликации ДНК, Dnmt1 располагается в репликационном комплексе, где узнает нормально метилированные CpG-динуклеотиды на матричной цепи ДНК, и катализирует перенос метильной группы на соответствующий цитозин дочерней цепи.

Активное привлечение фермента в сайты репликации ДНК помогает Dnmt1 выполнять функцию поддержания имеющегося паттерна метилирования. Функция ещё одной метилтрансферазы - Dnmt2 описанной Иодером и Бестором пока не ясна. Однако первичные данные позволяют предположить, что этот фермент не является необходимым для de novo метилирования в эукариотических клетках. Динамика паттерна метилирования подразумевает наличие механизма деметилирования ДНК.

В настоящее время известны два механизма этого процесса. Во-первых, это пассивное деметилирование, имеющее место быть в случае, когда Dnmt1 не способна поддержать имеющееся метилирование. Во-вторых, это активное деметилирование, осуществляемое недавно описанным ферментом – деметилазой.

3.3 Метилирование ДНК во время эмбриогенеза

Во время эмбриогенеза закономерно сменяют друг друга "волны" метилирования - деметилирования, в результате которых в конечном итоге устанавливается строго определенный рисунок метилирования конкретных генов и генома в целом. Он стабильно сохраняется в популяциях соматических клеток.

Так, на стадии 1-2-клеточных делений происходит тотальное деметилирование генома, устраняющее профиль, сформированный в исходных половых клетках. Оно продолжается до стадии имплантации бластоциста. Относительно природы этого процесса существуют две точки зрения.

Согласно гипотезе "активного деметилирования", остатки 5-метилцитозина удаляются из ДНК независимо от репликации благодаря активности обнаруженной в конце 90-х гг гликозилазы или ДНК-деметилазы. Последняя - весьма вероятный кандидат на роль агента, осуществляющего глобальное деметилирование генома.

Противоположная точка зрения заключается в том, что деметилирование генома в эмбриональном развитии - процесс пассивный, который сводится к подавлению сопряженного с репликацией так называемого "поддерживающего" метилирования. После имплантации бластоциста начинается процесс охватывающего весь геном метилирования (метилирование de поvо, профиль которого в целом сохраняется в соматических клетках взрослого индивидуума.

3.4 Регуляция экспрессии с помощью метилирования ДНК

В случае промоторов содержащих CpG островки, отсутствие метилирования, как правило, ассоциировано со структурой хроматина, характерной для активно транскрибируемых генов, а именно: открытая структура нуклеосом, пониженная концентрация гистона Н1 и наличие ацетилированных гистонов. Способность метилирования к выключению генов имеющих CpG островок в промоторе была исследована на примере инактивированных генов на Х-хромосоме.

Эксперименты по трансфекции показали, что инактивация происходит прежде всего в результате конденсации хроматина, формирующего структуру труднодоступную для транскрипционных факторов. В подобной ситуации метилирование конкретного цитозина, приводящее к нарушению связывания транскрипционного фактора в конкретном месте, играет незначительную роль. Существенно отличается от вышеописанной ситуация, когда в промоторе гена нет CpG островка. В этом случае метилирование каждого конкретного цитозина играет роль в регуляции экспрессии гена. Данное наблюдение объясняется зависимостью связывания транскрипционных факторов от наличия метилированных цитозинов в сайтах связывания. Этот феномен был описан для такого широко распространенного транскрипционного фактора как AP-2. Зависимость эффективности связывания от статуса метилирования была предположена и для Sp1, однако в этом случае данные остаются противоречивыми.

Другой механизм регуляции транскрипции на основании метилирования отдельных цитозинов базируется на активности метил связывающихся белков - MDBPs. Первый описанный белок этого семейства - MeCP1, описанный Мееханом с коллегами связывается в ДНК при наличии не менее 7-и метилированных CpG динуклеотидов, и поэтому не может играть важной роли в регуляции экспрессии генов, не имеющих CpG островка в промоторе. В отличие от MeCP1, MeCP2 (MDBP-2) достаточно единственного метилированного CpG динуклеотида для связывания и активного подавления транскрипции.

В дополнение к этим двум белкам Хендрих и Бёрд описали семейство белков с высокой степенью гомологии с MeCP2. Все белки этого семейства имеют ДНК связывающийся домен и домен, отвечающий за подавление транскрипции. Все эти данные в комплексе доказывают важность метилирования ДНК для регуляции транскрипции генов (см. Рис.2).

Рис.2. Метилирование ДНК, 5-метилцитозин (mC) и его дезаминирование, приводящее к нуклеотидным заменам, р – остаток фосфорной кислоты. Репликация ДНК при отсутствии ДНК-метилтрансферазы приведёт к «пассивному» деметилированию [1].

Дата добавления: 2015-12-08