Адаптивные модификации

Программа курса

Введение

Определение модификации. Относительность и противоречивость современной классификации типов изменчивости. Обсуждение модификаций как ненаследуемых изменений. Проблема определенной и неопределенной изменчивости Ч.Дарвина.

Типы модификаций.

Адаптивные модификации. Морфозы. Фенокопии. Фенотипическая супрессия. Длительные модификации. Спонтанные модификации по Б.Л.Астаурову. Норма реакции. Экспрессивность, пенетрантность. Проблема эпигенетической наследственности-изменчивости. Cомаклональная изменчивость.

Механизмы модификаций.

Адаптивные модификации (Регуляция, стрессы).

Регуляция действия гена у прокариот и эукариот как основа адаптивных модификаций. Транскрипция и ее регуляция у про- и эукариот. Репрессия и индукция. Опероны и регулоны. Усилители (энхансеры) и глушители (сайленсеры). Активный и неактивный хроматин.

Стрессовый ответ как генерализованная реакция клетки и организма. Белки стрессового ответа (белки теплового шока), регуляция стресс-реакции. Генетические регуляторные элементы (HSE) и регуляторные факторы - белки (HSF). Клеточные функции белков теплового шока. Шапероны и шаперонины.

Фенокопии.

Фенокопии мутаций (морфозы). Критические периоды.

Фенокопии нормы - фенотипическая супрессия.

Мутанты чувствительные к повышенной и пониженной температуре, к pH, осмосу и т.д. Модификации на уровне транскрипции, трансляции

Первичные повреждения ДНК.

Модификации как результат фенотипического проявления первичных (предмутационных) повреждений генетического материала. Примеры генетического анализа ненаследуемых изменений генетического материала. Система типов спаривания у дрожжей-сахаромицетов.

Шумы индивидуального развития. Врожденные аномалии.

Конститутивные и адаптивные системы репарации генетического материала. SOS- репарация. Параллельная индукция белков теплового шока и белков репарации. Взаимообусловленность модификаций и мутационной изменчивости. Пострадиационная (температурная) модификация мутационного процесса (Лобашев М.Е., Ватти К.В., Тихомирова М.М.).

Общие белки транскрипции и репарации. Транскрипция и мутационный процесс. Адаптивный мутагенез.

Проблемы эпигенетической наследственности-изменчивости.

Детерминация и трансдетерминация у дрозофилы.

Концепция эпигена Чураева Р.Н. (1975). Конструирование эпигена (2000).

Геномный импринтинг.

[Ферментативный импринтинг.]

Кортикальная наследственность у инфузорий.

Компартментализация генетических процессов. Ядерная оболочка. Хромосомные территории.

Длительные модификации.

Явление прионизации белков и прионный механизм наследования модификаций третичной структуры белков. Матрицы последовательности (I рода) и конформационные матрицы (II рода). Цитоплазматические стрессовые гранулы у мдекопитающих. Applisia.

Модификационная и наследственная изменчивость в синэкологических отношениях.

Симбиотическая наследственность или модификационная изменчивость?

Элементарные эколого-генетические модели. Дрожжи-дрозофила. Зависимость генетических процессов вида-потребителя от метаболизма вида-продуцента.

Инфекционная наследственность. Wolbachia у насекомых.

Феромональный стресс и генетические процессы у мышей.

Роль модификаций в эволюции.

Модификации как проба нормы реакции (Лукин Е.И., 1936, Кирпичников В.С., 1939).

Адаптивные системы репарации и мутационный процесс.

Парадоксы СТЭ: популяционная генетика и теория нейтральной эволюции, дупликация и дивергенция генетического материала через стадию псевдогенов. Наследуемые модификации (прионизация) факторов терминации и судьба псевдогенов (?).

Альтернативная классификация типов изменчивости: генетические процессы, связанные с воспроизведением и реализацией наследственной информации.

Принцип поливариантности матричных процессов. Взаимодействие матричных процессов I и II рода.

Заключение

Литература:

Астауров Б.Л. Исследование наследственного изменения гальтеров у Drosophila melanogaster Schin. Журн. Эксп. Биол. Серия А. 1927. Т.3. Вып.1-2. С.1-61.

Галл Я.М.Адаптивные модификации и естественный отбор (эволюционно-биологическое наследие Е.И.Лукина). Вестник ВОГиС. 2005. Т.9. №4. С.534-540.

Инге-Вечтомов С.Г., Лучникова Е.М. Почему лисички не червивеют? или Некоторые проблемы экологической генетики. Природа. 1992. N 1. С. 26 - 32.

[Инге-Вечтомов С.Г. Прионы дрожжей и центральная догма молекулярной биологии. Вестник РАН. 2000. Т. 70. N3. С. 195-202.]

Инге-Вечтомов С.Г. Возможная роль неоднозначности трансляции в эволюции генов. Молекулярная биология. 2002. Т. 36. N 2. С 268-276.

Инге-Вечтомов С.Г. “Матричный принцип в биологии. (Прошлое, настоящее, будущее?)”. Экологическая генетика. 2003. Т. 1. Вып. 0. С. 6 – 15.

С.Г.Инге-Вечтомов. Роль генетических процессов в модификационной изменчивости. Пророчество Б.Л.Астаурова. Онтогенез. 2005. №4. С. 274-279.

Инге-Вечтомов С.Г., Барабанова Л.В., Даев Е.В., Лучникова Е.М. Влияние экологических отношений на генетические процессы. Вестник СПбУ. 1999. Вып.4. №24. С.14-31

[В.Н. Куликов, О.Н. Тиходеев, Ф.С. Форафонов, А.С. Борхсениус, В.В. Аленин, С.Г. Инге-Вечтомов. Супрессия мутации "сдвиг рамки считывания" в результате частичной инактивации факторов терминации трансляции у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Генетика. 2001. Т. 37. N 5. С. 1-8]

Калинин В.Л. Транскрипция и регуляция экспрессии генов.СПб. Изд.СПбГТУ. 2001. 246 с.

Конюхов Б.В., Платонов Е.С. Геномный импринтинг у млекопитающих. ГЕНЕТИКА, 2001, том 37, N1, с.5-17

Левченко В.Ф. Эволюция биосферы. СПб, 2003. Ин-т эволюционной физиологии и биохимии РАН. 164 с.

Проворов Н.А. Генетико-эволюционные основы учения о симбиозе. Журн. общей биол. 2001. Т.62. С.472-495

Спирин А.С. "Рибосома и синтез белка".

Тер-Аванесян М.Д., Инге-Вечтомов С.Г. Генетический контроль синтеза белка. 1988. Изд ЛГУ. 294 с.

Тиходеев О.Н., Журина Т.В. Автономная изменчивость: феномен и возможные механизмы. Экологическая генетика. 2004. Т.II. Вып.2. С.3-10.

Чураев Р.Н. Контуры неканонической теории наследственности: от генов к эпигенам. Журнал общей биологии. 2005.Т.66.№ 2. С. 99-122.

Chernoff Y.O. Mutation process at the protein level: is Lamarck back? Mutation Res. 488 (2001) 39-64

Inge-Vechtomov S.G., Repnevskaya M.V. Phenotypic expression of primary lesions of genetic material in Saccharomyces yeast. Genome. 1989, 31: 497-502

Novina C.D., Sharp P.A. The RNAi revolution. Nature. 2004. V. 430. P. 161-164.

Prusiner S.B. Prions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 13363-13383.

Ronemus M., Martienssen R. Methylation mystery. Nature. 2005. V.433. P. 472-473.

Tchuraev R.N., Stupak I.V., Tropinina T.S., Stupak E.E. Epigen: design and construction of new hereditary units. FEBS Letters, 486 (2000) 200-202

Лекция 1

Введение

Многие факты, о которых пойдет речь, вы знаете из других курсов (молекулярной генетики, генетики синтеза белка, альтернативных генетических программ и т.д.). Наша задача рассмотреть (вспомнить) их под определенным углом зрения. Не случайно общая проблема кафедры – Роль генетических процессов в формировании и реализации нормы реакции, которая конкретизируется, как Генетические и эпигенетические механизмы (процессы) в наследственности и изменчивости.

«Механизмы модификаций» – только повод обратиться к проблеме изменчивости и переосмыслить то, что вам уже известно. Главная моя задача заставить вас задуматься….

Как известно, генетика – наука о наследственности и изменчивости.

«Эпиграф» из К.А.Тимирязева. История доказала, что он не прав во-первых. Думаю, что он не прав и во-вторых. Единственное справедливо, что такой теории еще нет, а то, что есть, не очень соответствует действительности.

Даже самые общие рассуждения о лежащей в основе разнообразия комбинаторике элементов неживой природы – элементарных частиц или атомов и даже химических группировок не идут ни в какое сравнение с тем, что мы наблюдаем в живой природе. Цифр, увы нет.

Классификация типов изменчивости.

Из всех типов изменчивости модификации изучены хуже всего. Модификации – ненаследуемые изменения организма (на всех уровнях). Так принято, но уже и это не строго. Определенная и неопределенная изменчивость Ч.Дарвина. Особое отношение модификационной и онтогенетической изменчивости. Критика принятой классификации. Нестрогость многих понятий. Например, транспозонный мутагенез, хромосомные и геномные мутации. Отсутствие строгого определения понятия «мутация». Что уж говорить о модификациях.

Примеры модификаций.

Звери и цветочки + сравнение хромосом молодых и старых близнецов. 40 пар от 3 до 74 лет. Показаны различия в замолкании и активации генов, связанные с присоединением химических групп (радикалов). Не модифицированные группы генов – желтым, старые наверху, молодые – внизу.

Значение модификационной изменчивости для медицины и сельского хозяйства. Фармакогенетика и фармако-метаболомика.

Еще одна цель курса – связь с проблемами Общей биологии.

Основная задача курса – рассмотрение типов изменчивости (прежде всего модификационной) в связи с основными генетическими процессами: репликацией, рекомбинацией, репарацией, транскрипцией и трансляцией. Условность понятия “генетические процессы”.

Значение транскрипции и трансляции как генетических процессов. Основы гетерокаталитической функции гена. Трансляция как основа генетической (генной) дискретности генетического материала. Т.е. в основу рассуждений положен матричный принцип, восходящий к Н.К.Кольцову “Omnis molecula e molecula” (1928), первоначально сформулированный им для репликации белковой хромосомы.

Сегодня это – центральная догма Ф.Крика.(1958). Которая неколебима по сей день, если говорить не о потоке информации, а именно о матричных процессах в клетке. Открытие белковой (прионной) наследственности – только модификация схемы, отражающая наличие в клетке двух типов матричных процессов – I рода (матрицы последовательности) и II рода (пространственные, или конформационные матрицы). При этом нужно помнить, что матричные процессы I и II рода могут взаимодействовать.

Нас будут интересовать преимущественно процессы, лежащие в основе реализации (экспрессии) генетической информации, зашифрованной в форме генетического кода для белков на всех ее этапах и не только …

Типы модификаций: адаптивные, морфозы – фенокопии мутаций, фенокопии нормы – фенотипическая супрессия, длительные модификации. Предетерминация цитоплазмы и эпигенетика.

ОТСЮДА ПО СТАТЬЕ “Пророчество Астаурова”:

Спонтанные модификации по Б.Л.Астаурову (1927). Мутация tetraptera у дрозофилы.

Частота “левых” и “правых” и симметричных аномалий – лишних крыльев при неполной пенетрантности. Вывод о существовании спонтанных нарушений в проявлении генетической информации – спонтанной модификационной изменчивости и неустойчивости действия гена. Сейчас в международных изданиях появилась довольно богатая литература о значении “шумов” в метаболических путях и матричных процессах, составляющих сущность живой материи, но без всяких ссылок на Б.Л.Астаурова.

Взаимообусловленность модификационной и наследственной изменчивости: норма реакции, экспрессивность, пенетрантность (Н.В.Тимофеев-Ресовский, 1925-27).

Обратная сторона взаимообусловленности модификаций и наследственной изменчивости – онтогенетические адаптации, обусловливающие чувствительность-устойчивость к мутагенным (генетически-активным) факторам среды. Не столь очевидный пример…, но – если считать культуру соматических клеток модификацией, то она приводит к сомаклональной изменчивости, которая носит наследственный характер.

Кроме того, мы увидим, что в некоторых случаях пути появления модификаций и наследуемых изменений (прежде всего мутаций) могут быть общими, а некоторые изменения, которые мы привыкли считать модификациями, тем не менее, наследуются.

[Сюда же тесно примыкает и проблема эпигенетической наследственности-изменчивости, обусловленной разнообразными механизмами, лишь косвенно связанными с кодированием (изменением кодирования) генетической информации в форме нуклеотидных последовательностей ДНК.] Сюда же относятся проблемы детерминации и трансдетерминации, особенно временной трансдетерминации клеток.

[Биологические часы? ]

Адаптивные модификации основаны на регуляции экспрессии генов

Примеры: реакция хлоропласта на чрезмерное освещение,

Осенние процессы “созревания” и опадания листьев,

У животных от густого подшерстка на холоду и до ВНД,

……………………………………

Адекватные изменения клеток и организмов по отношению к тем факторам, с которыми они неоднократно встречались в процессе эволюции.(Отсюда и определенная дарвиновская изменчивость – детерминированная реакция на внешние факторы). Это результат естественного отбора. Механизмы эти универсальны с некоторыми вариациями во всей живой природе. Они основаны, в конечном счете, на регуляции действия генов, регуляции их экспрессии, которая осуществляется на всех уровнях организации генетической информации. От избирательной репликации и до пост-трансляционных процессов, включая процессы сигнальной трансдукции.

Репликация. Например устойчивость к метатрексату в культуре клеток возникает в следствие амплификации соответствующих генов и сохраняется пока действует селективный фактор. Другой пример – избирательная сайт-специфическая репликация генов генов хориона в фолликулярных клетках дрозофилы. Кластер генов хориона на III хромосоме Белок Myb (миелобластоз - гомолог человечьего гена) – один из онкобелков вместе с 4 другими белками сайт-специфически связывается с локусом Ori-β

Другой крайний пример регуляции – деградация не работающих белков в протеосоме; образование т.н. стресс-гранул (SG) в цитоплазме после стресса, где концентрируются аномально-инициированные комплексы трансляции. Об этом – позже.

Лучше всего изучена (или наиболее распространена?)

Транскрипция и ее регуляция.

Все гены у E.coli (4291 ген, 2 350 000 белков, 10¹⁴ – 10¹⁶ реакций по В.Г.Дебабову) транскрибирует ДНК-зависимая РНК-полимераза. (только –с, a, b – не представлены)) Минимальный фермент у этой бактерии состоит из субъединиц αββ’ + сменные субъединицы для инициации – сигма-фактор (σ) и для терминации – ро-фактор (ρ). Существуют сменные σ: основной σ⁷⁰ (кодируемый геном rpoD) обеспечивает экспрессию генов домашнего хозяйства. Он узнает нуклеотидные последовательности ДНК, расположенные до точки старта транскрипции: -10(5’-TAGAAT-3’) и –35(5’-TTGACA-3’). Существуют т.н. минорные сигмы: σ³² (rpoH) для транскрипции генов теплового шока, σ⁵⁴ (rpoN) для транскрипции генов азотного метаболизма, σ³⁸ (rpoS) для перехода из экспоненциальной фазы роста клеток в стационар, σ²⁴ (rpoE) для “теплового удара” – 48^о, σ²⁸ (rpoF) для клеточной подвижности и хемотаксиса. Итого, -5. Все они узнают несколько различающиеся консенсусы в промоторах E.coli. У Bacillus subtilis - 17 минорных сигма-факторов. Только для различных стадий споруляции их – 5.

Молдель оперонной регуляции транскрипции у прокариот предложена Ф.Жакобом и Ж. Моно в 1961 г. Вспоминайте механизмы репрессии и индукции, аттенюации и антитерминации. В последнее время расшифрованы механизмы «не-белковой» регуляции. Riboswiches – рибопереключатели. В опероне синтеза S-аденозилметионина регуляция на уровне транскрипции – антитерминация, определяемая взаимодействием SAM непосредственно с мРНК.А также путем рибозимного разрезания мРНК. + пример в общей форме.

Транскрипция у эукариот

и ее регуляция обставлены значительно сложнее.

Напомним, что у человека, например – около 30 000 генов. Из них лишь небольшая часть контролирует различные транскрипционные (регуляторные) факторы. У арабидопсис – 2%, у дрозофилы – 5%. В среднем – 40-50 структурных генов на 1 ген, регулирующий транскрипцию.

Кроме того различные компоненты аппарата транскрипции вовлечены в несколько этапов этого процесса

У эукариот есть три РНК-полимеразы: PolI транскрибирует гены рРНК, PolII транскрибирует структурные гены (синтезирует иРНК), PolIII транскрибирует гены тРНК и 5S рРНК. Каждая РНК-полимераза имеет свой набор базальных факторов.

РНК-полимераза II: TFIID, B, E, F, H и A (наименее изученный). С ТАТА-блоком (-25) взаимодействует TFIID, состоящий из TBP, специфически взаимодействующего с TATA, и ассоциированных с TBP 8-12 субъединиц TAF (TBP Associated Factors). TBP (38 кД) –общий для всех трех полимераз. Все перечисленные компоненты составляют PIC – Pre-Initiation Complex.

Последним к PIC присоединяется TFIIH, состоящий из 9 субъединиц (32-89 кД). Самая большая (89 кД) – ERCC3 – белок эксцизионной репарации ДНК. Он умеет расплетать ДНК и РНК, т. е. является хеликазой 3’ – 5’. У человека дефект этого белка приводит к пигментной ксеродерме (XP-B) и к синдрому Кокейна. Другая субъединица – p80 (хеликаза 5’ – 3’), она же – ERCC2. Она дефектна в случае XP-D. В состав TFIIH у дрожжей входит также Cdc28 – фосфопротеинкиназа, ответственная за клеточный старт. В течение всей транскрипции с РНК-полимеразой II связан только TFIIF. К холоферменту отиносят еще около 20 белков.

Последовательные стадии работы эукариотической РНК-полимеразы

Регуляторные элементы (регуляторные последовательности) и регуляторные факторы (белки) эукариот показаны на примере простого и сложного промотора эукариот. Перечислить. Инсуляторы блокируют взаимодействие энхансера и промотора, определяя транскрипционно-активные районы.

Если с инициацией и элонгацией транскрипции более или менее понятно, то терминация стала проясняться только в последнее время. У дрожжей: с CTD (Carboxy Terminal Domain) РНК пол. II взаимодействуют белки – Rtt103, Rat1 – экзонуклеазы, которые расщепляют пре-мРНК в районе (до) сайта полиаденилирования. Разрыв, - полимераза идет дальше, а экзонуклеаза ест РНК 5’-3’, догоняет полимеразу, и та кончает.

У человека еще более интересные подробности: в районе (опять же – до) сайта полиаденилирования на мРНК есть сайт CoTC (cotranscriptional clivage) = с рибозимной активностью для раскусывания мРНК. + (присоединяется) белок Xrn2, который ест РНК 5’-3’, догоняет и кончает…

Интересно: исследовав 60 не родственников (людей), обнаружили большую вариабельность в экспрессии генов. В 40 случаях эта вариабельность коррелировала с SNP в не транскрибируемых участках.

Лекция 2

Регуляция транскрипции у эукариот осуществляется преимущественно на стадии инициации. Транскрипционные элементы (нуклеотидные последовательности) и транскрипционные факторы (белки).

Тр. Элементы: UAS (Upstream Activating Sequence - пре-активаторы), URS (Upstream Repressing Sequence – пре-подавители), энхансеры (усилители), сайленсеры (глушители).

Транскрипционные активаторы содержат домен AD, или домен активации, который связывается с РНК-полимеразой (или σ) и домен BD, или домен связывания с ДНК. Последний узнает UAS. AD и BD связаны гибкой линкерной областью. Пример – Gal4 дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Его BD можно заменить на аналогичный домен бактериального репрессора Lex A. Если в дрожжевую хромосому вставить 5’-регулируемую Lex A последовательность (бактериальную), слитую с каким-либо структурным геном-репортером, тогда такой химерный белок будет активировать соответствующий ген-репортер. Это отличная иллюстрация модульного принципа в организации регуляторных систем. AD консервативны в пределах надцарства. У эукариот они взаимодействуют с различными компонентами PIC, иногда через посредников – ко-активаторов. В активации может принимать участие энхансер. Белки, взаимодействующие с энхансером, изгибают ДНК, сближая его с UAS. Активации способствует ацетилирование и “разрыхление” гистонов.

Транскрипционные репрессоры. У бактерий репрессор связывается с ДНК, конкурентно по отношению к РНК-полимеразе (или белкам-активаторам) или препятствует движению РНК-полимеразы по ДНК. У эукариот механизм стерической интерференции (помех) встречается редко. У них репрессоры связываются с URS. Одни и те же белки могут выступать ко-активаторами для одних генов и ко-репрессорами для других. (Еще раз модульный принцип!). Примером могут служить белки Ada2 и Ada3 у дрожжей S. cerevisiae. Они могут стимулировать или подавлять транскрипцию некоторых генов, стимулируя или ингибируя некоторые белки-активаторы транскрипции. Репрессия может достигаться и деацетилированием гистонов при помощи гистондеацетилазы, которую привлекают к гистонам транскрипционные факторы.

Опероны и регулоны.

Хороший пример: SOS-репарация. Вспомните – активированный (не-репарированными повреждениями ДНК) белок RecA действует на белок LexA, индуцируя его самопереваривание(между Ala84 и Gly85).Тем самым репрессор оказывается инактивированным и индуцируются около 20 опероновSOS-регулона и в том числе UMUD, UMUC, участвующих вместе с RECA в репликации в обход повреждений. Т.о. SOS-репарация = репарация, склонная к ошибкам. Мутагенез!.. Связь адаптивной модификации и мутацтонного процесса.

У эукариот нет оперонов, не верьте, что они есть у C.elegans (по крайней мере, что есть классические опероны, как у E. coli). Эукариотические рибосомы не умеют реинициировать трансляцию после нонсенса. И C.elegans – не исключение (или своего рода исключение в смысле “оперонной” организации). У этого червя – гены собраны в кластеры, с которых транскрибируется единая пре-мРНК, но затем она разрезается на куски, соответствующие отделным генам.

Полиаденилирование и де-полиаденилирование как механизмы регуляции через определение времени жизни мРНК. В этом процессе принимает участие Hsp70, связываясь с …AUUUA…- мотив, который повторяется несколько раз в 3’-UTR вблизи сайта полиаденилирования.

Дифференциальный, или альтернативный сплайсинг, особенно часто используется в образовании белков сигнальной трансдукции и прочих регуляторов в широком смысле.

Альтернативный сплайсинг находится под контролем негативной и позитивной регуляции, т.е. вырезание интрона может быть подавлено или стимулировано. Пример – альтернативный сплайсинг мРНК гена ras человека. Пре-мРНК (c-H- ras) может быть процессирована в две разные мРНК, благодаря сохранению или исключению т.н. альтернативного экзона IDX: для белков p21H-Ras и p19H-RasIDX, которые различаются только своим c-терминальным доменом. Последовательность после интрона – его сайленсер (rasISS1) действует вместе c IDX. Это - цис-активный элемент для негативной регуляции сплайсинга предшествующего интрона (т.е.IDX). Он связывает hnRNP A1. Наличие или отсутствие этого RNP in vitro (в ядерных экстрактах) коррелирует с подавлением или стимуляцией эксцизии IDX. Ингибирование сплайсинга снимает добавка двух белков: SC35 и SRp40. Эффект показан in vivo и in vitro. Кроме того в этом процессе участвует РНК-зависимая хеликаза p68. Если ее подавить, используя технику антисмысловой РНК (RNAi), то частота включения IDX в мРНК возрастает. Сделано на клетках HeLa (S.Guil et al., 2003).

Дифференциальный сплайсинг претерпевают про-мРНК около 35% генов млекопитающих. У человека – 60%.

Пример возможного молекулярного механизма экспрессивности и пенетрантности в связи с альтернативным сплайсингом. Альтернативный сплайсинг известен у мышей в гене Axin^Fu (с ретротранспозоном Intracisternal-A particle в интроне 6). Он происходит также у дикого типа, но в меньшей степени. Наблюдается корреляция между частотой аномалий развития хвоста и соотношением нормального и альтернативного сплайсинга пре-мРНК. Чем чаще альтернативный сплайсинг, -тем сильнее проявляется мутантный фенотип (W.D.Flood, A.Ruvinsky. 2001. Heredity. V. 87. P. 146-152). Транскрипты около “… можно ожидать, что появятся мыши, не имеющие мутантного аллеля, и тем не менее проявляющие ненаследуемые аномалии хвоста, похожие на классический фенотип “fused”. Вариации генотипического фона и факторов среды могут влиять на частоту и степень проявления нарушений развития хвоста у мышей Axin^Fu. Этот ген кодирует белок-компонент сигнального пути, ответственного за формирование эмбриональных осей симметрии млекопитающих.

[Транс-сплайсинг.]

[Белковый “сплайсинг”.]

Регуляция на уровне трансляции.

Общая схема трансляции у бактерий.

[Белковый сплайсинг, которого пока нет]

Ауторегуляция оперонов рибосомных белков у бактерий (на уровне транскрипции и на уровне трансляции). Синтез рибосомных белков кодируют опероны, которые состоят только из структурных генов этих белков или включают также гены факторов трансляции, гены для субъединиц РНК-полимеразы, а также гены, контролирующие метаболизм РНК. Специфической чертой этих оперонов является аутогенная регуляция их транскрипции и трансляции. Обычно один из рибосомных белков, кодируемых опероном играет роль трансляционного репрессора (см.табл.), связывающегося с мРНК вблизи участка инициации транскрипции. Эти белки входят в число тех, что связываются непосредственно с рРНК в начале синтеза рибосом. В ряде случаев наблюдается явное сходство участков связывания этих белков в рРНК и в мРНК оперонв (см. рис.).

М.Номура и др. изменяя мутационным путем почти каждый нуклеотид в этих гомологичных структурах, показали, что они важны, как для регуляции соответствующего оперона, так и для сборки субчастицы 50S рибосомы.

Наряду с ауторегуляцией на уровне трансляции рибосомные белки могут осуществлять также и репрессию собственного синтеза на уровне транскрипции. Примером является белок L4, кодируемый третьим геном оперона S10, включающего 11 генов рибосомных белков. L4 участвует в аттенюации оперона - (NuSA -зависимой)- терминации транскрипции, происходящей приблизительно через 140 оснований после старта транскрипции и более, чем за 30 оснований до первого гена, как показали Дж.Зенгел и Л.Линдаль.

Мутанты с конститутивной, как транскрипцией, так и трансляцией получены по белку L4. Каждая из функций может быть изменена независимо от другой: трансляционная дерепрессия не сопровождается дерепрессией транскрипционной и наоборот.

Бактериофаг MS2.

Регуляция инициации, приводящая к дифференциальной трансляции разных генов показана для РНК-содержащего бактериофага MS2. Белковый фактор i (interference factor), связываясь с фактором инициации IF-3, меняет его сродство к различным участкам инициации. Фактор i эффективно ингибирует инициацию в гене белка оболочки РНК-содержащих фагов, не препятствуя при этом инициации в генах РНК-репликазы и белкаА.

Ещё более эффективным (по сравнению с фактором i) ингибитором синтеза белка оболочки бактериофага MS2 является сама РНК-полимераза, в состав которой фактор i входит в качестве одной из четырех субъединиц (рис.). Две другие субъединицы РНК-полимеразы представляют собой факторы элонгации EF-Tu и EF-Ts.

Три перечисленных белка, входящие в состав РНК-полимеразы, кодируют гены E.coli, и только одну субъединицу кодирует ген РНК-репликазы бактериофага. РНК-полимераза подавляет синтез белка оболочки, присоединяясь к области инициации соответствующего гена.

Система GCN4 у дрожжей (регуляция на трансляционном уровне).

Регуляция самого этапа трансляции в экспрессии генов, контролирующих метаболические процессы, встречается редко. Наиболее подробно охарактеризована работами А.Хиннебуша и др. система регуляции аминокислотного метаболизма у дрожжей Sacch.cerevisiae, находящаяся под контролем гена GCN4.

При аминокислотном голодании усиливается экспрессия позитивного регулятора - GCN4 и контролируемых им нескольких десятков генов, имеющих последовательность: TGACTC, повторяющуюся в 5`-не транслируемой области. В лидерном участке самого GCN4 есть 4 коротких (3-4 кодона) открытые рамки считывания (см.рис.), начинающиеся кодоном-инициатором и кончающиеся терминатором. Как мы отмечали на с., присутствие таких uORF (upstream Open Reading Frame) в мРНК эукариот подавляет инициацию на кодирующей последовательности, поскольку эукариотические рибосомы не склонны к реинициации.

Делеция всех четырех uORF или мутационная инактивация их инициаторов приводит к высокому уровню нерегулируемой экспрессии GCN4. Если же перенести эти 4 uORF в лидер другого транскрипта, то соответствующий ген экспрессируется и регулируется, как GCN4. Для эффективной работы лидера GCN4 существенная, как последовательность 4-х uORF, так и их размер, а также нуклеотидное окружение. Участки uORF гена GCN4 сами находятся под позитивным контролем генов GCN2 и GCN3, а также под негативным контролем генов серии GCD и по меньшей мере двух генов SUT2 и SUT3, кодирующих a и b субъединицы фактора инициации трансляции - eIF - 2 (см.рис.).

Адаптивные модификации

Клеточный стресс, белки теплового шока, шапероны. Ritossa, 1962.

Реакция на тепловой шок – пример адаптивной модификации с регуляцией на транскрипционном уровне.

Реакция клетки (организма) на стрессирующие воздействия включает синтез ряда белков. Их набор перекрывается при разных стрессирующих воздействиях: на высокую и низкую температуры, окислительный стресс, этанольный и т. д. Лучше всего изучен тепловой шок. Существует система консервативных (семейств) белков теплового шока, синтезируемых в ответ на Т-шок у всех организмов: Hsp70, Hsp60, Hsp90. Все белки ТШ – шапероны, т. е. белки, которые cвязывают “свежие”, частично-денатурированные (unfolded) или несобранные (unassembled) белки, участвуя в их биогенезе: (1) блокируя ошибочные (nonproductive) взаимодействия и (2) стимулируя правильную сборку доменов (друг с другом) и олигомеров белков. Основные две группы молекулярных шаперонов: 70 кД (Hsp70) и 60 кД (шаперонины, или Cpn 60). Они “цепляют” частично денатурированные (unfolded) белки или готовые полипептиды по выходе из рибосом и заканчивают их укладку. Некоторые Hsp 70 локализованы на внутренней мембране митохондрий и на эндоплазматическом ретикулуме. Они обеспечивают транспорт белков через мембраны.

Наряду с Hsp 70, Hsp 60, исследованными лучше всего, известны и другие шапероны – Hsp 90, пролин-изомеразы, дисульфид-изомеразы, которые участвуют в складывании белков. Некоторые шапероны, например, Hsp 104, синтезируемые только при температурном шоке, видимо, делают примерно то же.

Hsp 70 (КАРТИНКА) очень консервативны от бактерий (DNAK E. coli) до человека имеют 50-90% идентичности по аминокислотам (по первичной структуре). Среди эукариот это семейство имеет 50-98% идентичности. У дрожжей их 8 штук. Связывает АТФ и пептиды, обладает слабой АТФазной активностью. Предполагается, что С-терминальный домен похож на антиген комплекса гистонесовместимости I класса. Предварительные данные ЯМР показывают, что DnaK связывает, по меньшей мере, один пептид, независимо от его структуры. Освобождение пептида сопровождается гидролизом АТФ, что указывает на взаимодействие между С-доменом (связывающим пептид) и N-доменом (АТФазным). Из 8 Hsp 70 S. cerevisiae один член этого семейства – митохондриальный (Ssc1p), более всего похож на бактериальный (E. coli), а не на какой-либо другой Hsp 70 эукариот. Симбиогенетика, однако. Инактивация Ssc1p блокирует импорт белков в митохондрии.

Ssc1p одновременно служит некаталитической субъединицей эндонуклеазы. Эндо Sce1 осуществляет двойные разрывы в строго-определенных местах ДНК, расщепляя мито-ДНК на несколько фрагментов in vitro. Похоже, она вовлечена в общую рекомбинацию мито-ДНК. Опять же модульный принцип. Вспомните такие примеры, когда речь зайдет о связи модификационной и наследственной изменчивости.

Hsp 70, локализованный в эндоплазматическом ретикулуме, он же Kar2p. KAR2 существен для жизнеспособности. Kar2 участвует в транслокации белков через мембраны и взаимодействует с Sec61. Мутанты kar2 имеют фенотип Hfc и взаимодействуя с sup35 (45) часто дают летальный эффект (Тихомирова, не опубл).

Hsp 70 в цитоалазме – гены SSA, SSB Экспрессию трех из четырех генов SSA индуцирует Т-шок. Экспрессию SSB Т-шок подавляет. Гены SSA незаменимы. Если все их делетировать, клетка погибает. Сходство этих четырех генов SSA у дрожжей – от 80 до 97%. Белки Ssa имеют перекрывающиеся, но не идентичные обязанности в клетке. Все они вовлечены в транслокацию белков.

Два гена SSB идентичны на 99% по первичной структуре кодируемых ими белков. Дизрупция обоих генов (но не каждого в отдельности) приводит к замедлению роста при всех температурах и к холодо-чувствительности. До 73% SsBp связаны с рибосомами, точнее с синтезируемыми полипептидами, поскольку SsBp освобождается при действии пуромицина и аналогов аминоацил-тРНК. Двойные мутанты ssb1 ssb2 растут медленно (см. ранее). Этот эффект подавляет сверх-экспрессия генов TEF, кодирующих фактор элонгации EF1A. Кроме того ssb1 ssb2 обладают повышенной чувствительностью к ингибиторам трансляции: аминогликозидам и verucarin A. У них уменьшено количество активных рибосом. Т.о. Ssb действительно играют какую-то роль в трансляции. По мнению Нельсона (Nelson et al. 1992. Cell. Vol. 71. P. 97-105) Ssb цепляют полипептид в Exit-сайте рибосомы.

Белки, взаимодействующие с Hsp 70 (гомологи DnaJ). У кишечной палочки DnaK (Hsp70) взаимодействует с DnaJ (стимулирует гидролиз АТФ) и GrpE (способствует освобождению связанного нуклеотида). У дрожжей похоже 4 гомолога DnaJ.

Hsp 60. Шаперонины.

Митохондриальный Hsp 60 – гомолог системы GroEL-GroES бактерий – “горшочек с крышечкой”. Участвует в транспорте и созревании митохондриальных белков. АТФ-зависим.

Цитоплазматические Hsp 60 делают то же, что и митохондриальный, но в цитоплазме. Пока изучен один жизненно-важный ген из этой серии – TPC1. Мутанты по этому гену чувствительны к беномилу. Похоже, Tpc1p непосредственно связывается с тубулином, превращая этот белок в форму, образующую димеры и далее полимеризующуюся в микротрубочки. Hsp 70 и Hsp 60 вовлечены в единый путь транспорта, складывания и созревания белков.

Hsp 90 консервативны у бактерий и эукариот и преимущественно находятся в цитоплазме. У дрожжей –2 белка – Hsc 82. Один конститутивный, а другой с низким базальным урровнем, синтез которого повышается в 10-15 раз при температурном шоке. Дизрупция обоих генов безусловно летальна. Дизрупция каждого из них приводит к термочувствительному росту. Участвуют в складывании активной конформации белков. Взаимодействуют со стероидным рецептором, как условие связывания гормона, что в свою очередь необходимо для связывания с ДНК. Освобождение Hsp 90 из комплекса превращает его из не связывающего ДНК в связывающий ДНК. Drosophila и Arabidopsis истории С.Линдквист (1998, 2002), показывающие роль Hsp90 в нейтрализации малых мцутаций и аномалий белковых молекул – “фенотипический буфер”.

+ два класса консервативных белков – протеин дисульфид изомеразы и пептидил-пролил цис-транс изомеразы. Для того и другого класса белков у дрожжей по несколько генов.

Hsp 104 сильно индуцируется температурой. При нормальной температуре базальный уровень низок. Не существенен для жизнеспособности, но важен для термотолерантности. Дезагрегаза. Участвует в [PSI]-story, как транс-активный фактор, отвечающий за образование “семян”.

Система клеточных шаперонов работает взаимосвязанно с системой протеолиза. Инактивированные температурой белки могут быть: (1) восстановлены, например при действии DnaK и его гомологов Hsp 70 или (2) уничтожены по принципу “кто не работает, того едят”. Главный путь деградации – через убиквитин ирование. Деградация белков индуцируется стрессорами, например температурой или аналогами аминокислот, например, канаванином (аналог аргинина). Убиквитин – консервативный белок в 76 аминокислот, активируемый специальным белком-активатором (гены UBA, 1 изолирован). Активированный убиквитин переносится на убиквитин-конъюгирующий фермент (гены UBC, их по меньшей мере 10), а отуда на белок-субстрат, который таким образом метится и далее переваривается в протеосоме. Система консервативна. В клетках млекопитающих – цилиндрическая структура 20S, состоящая, по меньшей мере, из 12 разных белков, уложенных четырьмя кольцами в стопку. Сам комплекс обладает протеазными активностями (тремя). Дополнительный белковый компонент привносит способность переваривать убиквитинированные белки при образовании комплекса 26S.

У дрожжей UBI4 – единственный термоиндуцируемый ген кодирует 5 тандемных повторов убиквитина, которые пост-трансляционно расщепляются до уби-мономеров. UBI1-UBI3 кодируют фьюжены уби- с некоторыми рибосомными белками. Делеция UBI4 не сказывается при росте в диапазоне температур от 23 до 36^о, при 16^о и при 38,5^о жизнеспособность клеток резко снижена – до 1-5% по сравнению с 60% (?) для дикого типа.

Гены убиквитин-конъюгирующих ферментов много что умеют: UBC2 = RAD6, UBC3=CDC34 вовлечены соответственно в репарацию ДНК и в переход G₁ – S в клеточном цикле. UBC1, UBC4, UBC5. UBC4, UBC5 конститутивны и индуцируются при высокой температуре.

HSE (Heat Shock Element) - транскрипционный элемент, необходимый для индукции (на уровне транскрипции) генов теплового шока. Это – 5 оснований: nGAAn в разных ориентациях. Для связывания белка Hsf (Heat shock factor) нужны как минимум два таких пентаплета. Пример HSE D. melanogaster из гена, кодирующего Hsp 83:

Дата добавления: 2015-10-23