Лабораторная работа №3

Тема: Приготовление питательных сред. Выполнение посевов и пересевов микроорганизмов

Цель: 1. Научить приготавливать питательные среды, производить посев и пересев микроорганизмов.

Материалы и оборудование:

Пробирки, чашки Петри, термостат, электроплитки, сухие питательные среды, бактериологические петли, шпатели, весы с разновесами, мензурки на 100 мл, сухие питательные среды.

Общие положения и методика выполнения работы:

Выращивание (культивирование) микроорганизмов широко применяется для выделения, накопления и со­хранения их. В лабораторных условиях микроорганиз­мы выращивают при качественном анализе микрофло­ры различных объектов, при количественном анализе — для подсчета жизнеспособных клеток, а в производст­венных условиях — для накопления полезных человеку микроорганизмов и продуктов их обмена веществ.

Среда, используемая в лабораторных условиях для накопления микроорганизмов и продуктов их жизнедея­тельности, называется питательной. К питательным средам для выращивания микроорганизмов предъявля­ют определенные требования: они должны содержать необходимые питательные вещества в легкоусвояемой форме (азотистые, углеводные, минеральные вещества, витамины), должны быть изотоничны по отношению к микробной клетке, обладать буферными свойствами, иметь оптимальную вязкость и определенный оки­слительно-восстановительный потенциал. Обязатель­ное условие — стерильность питательных сред, по­скольку посторонние микроорганизмы изменяют свой­ства среды и затрудняют культивирование и изучение определенных микробов.

Универсальных сред, пригодных для всех видов микроорганизмов, не существует. Отдельные виды микробов в зависимости от особенностей обменных про­цессов нуждаются в различных питательных веществах и условиях культивирования.

В качестве питательной среды в ряде случае используют натуральные продукты (картофель, молоко и т.д.). Такие среды называются естественными. Однако чаще питательные среды, используемые в лабораторной практике, являются искусственными, т.е. приготовленными в лаборатории специально для данной цели по определенными рецептам.

Питательные среды различные по составу, консистенции и назначению.

Состав сред. В микробиологической практике широко применяют так называемые простые (или обычные) среды, пригодные для культивирования многих видов микроорганизмов. К простым средам для выращивания бактерий относят мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА). Пептон, мясная вода, входящие в состав этих сред, служат источником азота, углерода, зольных элементов и факторов роста, необходимых для микробной клетки. Простые среды для выращивания микроскопических грибов – неохмеленное пивное сусло и сусло-агар.

Сложные среды готовят, как правило, на основе простых, добавляя к ним питательные вещества, необходимые для более требовательных видов микроорганизмов (например, сахарный бульон, кровяной агар и др.).

Консистенция сред. По консистенции питательные среды бывают жидкими, полужидкими и плотными.

К жидким средам относят мясопептонный бульон, сусло и др. Уплотнение сред достигается добавлением к жидким средам агар-агара и желатина.

Агар (по-малайски – желе) – плотный волокнистый материал, получаемый из морских водорослей и образующий в водных растворах плотный гель. Агар растворяется в воде при нагревании и застывает при комнатной температуре. Благодаря способности придавать питательному продукту, консистенцию плотного студня и высокой устойчивости к ферментативному действию микробов агар широко применяется при изготовлении полужидких (0,5% агара) и плотных (1-2%) питательных сред.

Желатин - белковое вещество животного происхождения. Применение его как уплотнителя ограничено из-за низкой (22-27 ) температуры разжижения.

Плотными средами являются, например, мясопептонный агар (МПА), сусло-агар (СА), мясопептонный желатин.

Назначение сред. В зависимости от задач исследования, кроме простых сред, используемых для выращивания многих видов микробов, применяют элективные и дифференциально – диагностические среды.

Внимание! При посеве культуры необходимо соблюдать стерильность, т.е. предотвращать возможность загрязнения исследуемого материала и питательных сред посторонними микроорганизмами.

Посев на плотные среды в чашках Петри

Посев осуществляют различными методами в зависимости от его цели: выращивание микроорганизмов в толще среды или на ее поверхности.

Для глубинного посева (в толще среды) используют обычно мерные количества плотной среды, заготовленные в пробирках по 10-15 мл. Культуру вносят в пробирки с расплавленными и охлажденными до 40-45 агаром, а затем заливают смесь в чашку Петри. Возможен и другой способ глубинного посева: взвесь микроорганизмов вносят непосредственно в стерильную чашку Петри на дно, слегка приоткрыв крышку, а затем заливают ее расплавленным и охлажденным агаром. Среду с культурой тщательно перемешивают круговыми движениями чашки, не поднимая ее с поверхности стола. После этого чашку оставляют на столе до застывания агара.

Рисунок 1. Посев микроорганизмов на поверхность плотной среды

а – шпатель Дригальского; б – положение чашки и руки при посеве шпателем; в – рост микроорганизмом после рассева шпателем; г – рост микроорганизмов после рассева петлей.

Для поверхностного роста исследуемый материал наносят на поверхность уже застывшей среды. По пластине агара материал распределяют с помощью шпателя или бактериологической петли.

При посеве шпателем (стеклянной палочкой, согнутой в виде треугольника) (рис. 1, а) чашка с застывшей средой находится на поверхность агара определенное количество (петлю, каплю или определенный объем) культуры (б). Круговыми движениями шпателя распределяют культуру по всей поверхности среды (а).

При использовании бактериологической петли посев осуществляют штриховым способом. Чашку Петри кладут на стол дном кверху и левой рукой вертикально, и осторожно, не разрывая среду, сеют культуру петлёй зигзагообразными движениями (г).

Выполнение посева микроорганизмов на питательной среде:

1.Взятие пробы воздуха.

1.1. В чашки Петри разливают, соблюдая правила стерильности расплавленный на водяной бане питательный агар.

1.2.В избранном для анализа микрофлоры воздуха, помещении (аудитория, коридор, гардероб) чашки Петри ставят на горизонтальную поверхность и открывают крышки на 10 мин. Исследователь должен находиться вдали от чашек. Затем чашки закрывают, помечают карандашом и помещают в термостат с Т -25". Через 48 часов на поверхности наблюдают развитие колоний микроорганизмов.

2. Взятие пробы воды.

2.1. Для исследования в стерильные колбочки берут водопроводную воду и воду из открытого водоема. Воду из открытого водоема разводят не менее чем 1:1000.

Разведение: готовят 3 пробирки с 9 мл. стерильной воды в каждой из них. В пробирку наливают 10 мл воды (после стерилизации в автоклаве, ее в пробирке остается 9 мл) Пробирки нумеруют. Стерильной пипеткой берут I мл. исследуемой воды, вносят в пробирку №1 с 9 мл стерильной воды, обжигая при этом, пробирку и горлышко пробирки на пламени спиртовки (разведение берут 1:10). Затем после перемешивания воды свежей стерильной пипеткой берут I мл из пробирки № I и вносят в пробирку №2 (разведение берут 1:100). После перемешивания воды в пробирке № 2 новой стерильной пипеткой берут из нее I мл и вносят в пробирку № 3 (разведение будет I: 1000).

2.2. Посев производят следующим образом.

Из пробирки последнего разведения берут I мл. воды и вносят в пробирку со стерильной расплавленной средой (Т=45^(;). Содержимое перемешивают и быстро вливают в стерильную чашку Петри. Соблюдая правила стерильности Чашку закрывают и помещают в термостат на 3-5 суток для выращивания.

3.Техника, посева смывов с рук.

3.1. 1 мл. смывной воды (грязные руки, руки, вымытые с мылом и без мыла) стерильной пипеткой помещают в чашку Петри со стерильной питательной средой. Гермостатируют 40 часов

Задание 1. Приготовьте сухой питательный агар.

Задание 2. Произведите разливку питательных сред.

Задание 3. Произведите стерилизацию среды.

Задание 4. Сделайте посев микроорганизмов на питательной среде с воздуха, воды и рук.

Задание 5. Вырастите культуры микроорганизмов в термостате.

Контрольные вопросы:

1. Дайте определение понятию - естественные питательные среды.

2. Дайте определение понятию - искусственные питательные среды.

3. Перечислите методы стерилизации посуды и питательных сред.

4. Перечислите и классифицируйте методы стерилизации посуды и питательных сред.

5. Охарактеризуйте искусственные питательные среды.

6. Объясните в чем сущность стерилизации на пламени горелки.

7. Объясните в чем сущность стерилизации кипячением.

8. Объясните в чем сущность стерилизации сухим жаром.

9. Объясните в чем сущность дробной стерилизацией.

Список литературы:

1. Азаров, В.Н. Основы микробиологии и санитарии / В.Н. Азаров. – М.: Экономика, 1986. – 349 с.

2. Березин, И.В. Биотехнология и ее перспективы / И.В. Березин. – М.: Знание, 1986. – 294 с.

3. Богданов, В.М. Техническая микробиология пищевых продуктов / В.М. Богданов. – М.: Пищевая промышленность, 1968. – 395 с.

Дата добавления: 2015-10-23