Создание аттенуированных вакцин

В некоторых случаях в качестве живых вакцин можно использовать генетически модифицированные (рекомбинантные) микроорганизмы (бактерии или вирусы). Такие вакцины содержат либо непатогенные микроорганизмы, синтезирующие антигенные детерминанты определенного патогенного агента, либо штаммы патогенных микроорганизмов, у которых модифицированы или делетированы гены вирулентности. В этих случаях основные антигенные детерминанты являются составными компонентами бактериальных или вирусных частиц и имеют такую ж конформацию, какую они принимают в болезнетворном микроорганизме. Изолированный антиген часто утрачивает исходную конформацию и вызывает лишь слабый иммунный ответ.

Противохолерные вакцины

Живые вакцины, как правило, гораздо более эффективны, чем неживые или субъединичные. Основное требование, предъявляемое к ним, отсутствие в инокуляционном материале вирулентных микроорганизмов. Это требование учитывалось и при создании живой противохолерной вакцины. Холера быстро развивающаяся кишечная инфекция, характеризующаяся лихорадкой, диареей, болью в животе, дегидратацией; передается через питьевую воду, загрязненную фекалиями. В развивающихся странах, где системы очистки воды и удаления сточных вод недостаточно развиты, угроза холеры вполне реальна. Возбудителем холеры является Vibrio cholerae. Бактерия размножается в тонком кишечнике и выделяет в большом количестве энтеротоксин, который и ответствен за патогенный эффект. Энтеротоксин это гексамерный белок: он состоит из одной субъединицы А, которая обладает ADP-рибозилирующей активностью и стимулирует аденилатциклазу, и пяти субъединиц В, которые специфически связываются с клеточным рецептором слизистой кишечника. Субъединица А имеет два функциональных домена: А₁, обладающий токсической активностью, и А₂, отвечающий за ее связывание с субъединицами В. В настоящее время используется противохолерная вакцина содержащая убитые фенолом холерные вибрионы; она обеспечивает только частичную защиту от инфекции и лишь в течение 36 мес. Поэтому были предприняты попытки создать другие типы противохолерной вакцины.

Как показали проведенные ранее исследования субъединичная вакцина, содержащая инактивированный холерный энтеротоксин, не приводит к выработке полноценного иммунитета. Поскольку V. cholerae колонизирует слизистую кишечника, разумно было предположить, что наиболее эффективной будет пероральная противохолерная вакцина. Имея это в виду, создали штамм V. cholerae, из генома которого была делетирована часть кодирующей А,пептид нуклеотидной последовательности. Этот штамм не синтезирует энтеротоксин, а потому не является патогенным и подходит для создания живой вакцины.

Эксперимент состоял в следующем. В ген А₁-пептида V. cholerae был встроен ген устойчивости к тетрациклину. При этом прерывалась рамка считывания для А1-пептида, но штамм становился устойчивым к тетрациклину. Его нельзя было использовать в качестве вакцины и потому, что со временем происходила спонтанная утрата тетрациклинового гена, и синтез энтеротоксина восстанавливался. Чтобы обойти эту проблему, создали штамм с дефектной нуклеотидной последовательностью, кодирующей А1-пептид, которая не могла восстанавливаться.

Полученный таким способом стабильный штамм с делетированной кодирующей А пептид последовательностью не синтезировал активный энтеротоксин и при этом сохранял все остальные биохимические свойства патогенной формы V. cholerae.

Противосальмонеллёзные вакцины

Другой способ получения непатогенных штаммов, пригодных для создания на их основе живых вакцин, состоит в удалении из генома патогенных бактерий хромосомных областей, отвечающих за независимые жизненноважные функции. При этом лучше делетировать по крайней мере две такие области, поскольку вероятность их одновременного восстановления очень мала. Предполагается, что штамм с двойной делецией будет обладать ограниченной пролиферативной способностью и сниженной патогенностью, но обеспечит выработку иммунного ответа.

Разные штаммы Salmonella вызывают острые кишечные инфекции, постнатальную инфекцию, брюшной тиф, пищевую токсикоинфекцию. Для профилактики всех этих заболеваний совершенно необходимо иметь эффективную вакцину. Чтобы получить аттенуированные штаммы Salmonella, вносили делеции в гены, кодирующие ферменты биосинтеза ароматических соединений, и в гены pur, кодирующие фрагменты метаболизма пуринов. Такие штаммы с двойной делецией вызывают легкую форму инфекции и обладают в 10⁶ раз меньшей вирулентностью. На их основе уже созданы эффективные пероральные вакцины для мышей, овец, крупого рогатого скота, цыплят, а совсем недавно и для человека.

Противолейшманиозные вакцины

Простейшие паразиты Leishmania тоже могут вызывать у человека развитие иммунного ответа, однако создание эффективных вакцин против них представляет собой нелегкую задачу. С этой целью можно использовать аттенуированные линии Leishmania, но они часто ревертируют и становятся вирулентными, а кроме того, могут длительное время бессимптомно персистировать в организме человека резервуаре инфекции и передаваться другим людям. Чтобы решить эти проблемы, попытались создать аттенуированную неревертируюшую линию Leishmania с помощью делеции одного из важ­ных для метаболизма генов (например, гена дигидрофолатредуктазы-тимидилатсинтазы). У одного из таких паразитов, Leishmania major Е10-5АЗ, два гена дигидрофолатредуктазы-тимидилатсинтазы были заменены генами устой­чивости к антибиотикам G-418 и гигромицину. В отличие от паразитов дикого типа, при выра­щивании L. major E10-5A3 в обычной культуре или в культуре макрофагов в среду необходимо добавлять тимидин. В организме мы­шей BALB/c паразиты оставались жизнеспособ­ными в течение нескольких дней, что достаточ­но для создания стойкого иммунитета у животных, но недостаточно для раз­вития заболевания. Ни персистирующая инфекция ни заболевание не возникали даже у наибо­лее чувствительных видов мышей, так что дан­ная линия вполне подходит для создания вакци­ны. Проведя дополнительные эксперименты на животных, можно будет проверить ее эффектив­ность при иммунизации человека.

Дата добавления: 2015-07-07