Технология получения ценных форм и сортов методом in vitro

Этапы метода:

6. Выбор подходящего сорта, генотипа, а также нужной части растения для закладки культур

7. Непосредственная закладка стерильной культуры, создание необх усл (тем-ра, освещ-ть)

8. Регенерация жизнеспособности раст

9. Перевод отобранных для селекции раст в грунтовую культуру

10. Дальнейший селекционный процесс

Ткани в культуревыращиваются в стерильных условиях, поэтому необходимы специальные помещения и оборудование. В методических рекомендациях указывается, что для выращивания изолированных зародышей растений в культуре следует иметь три отдельные комнаты, в частности: рабочую комнату для мойки и сушки посуды, приготовления ватных пробок и питательных сред; комнату-бокс или операционную, где изолируются, стерилизуются и пересаживаются на питательные среды кусочки размножаемых тканей; культуральную комнату для выращивания культур. Кроме того рекомендуется иметь подсобное помещение для хранения химикатов.

В помещениях необходим набор посуды, холодильные камеры, термостаты, инструменты для изоляции растительных объектов, вытяжные шкафы, водопровод, канализацию, дополнительное освещение, набор химикатов для составления питательных сред.

Питательная среда должна включать такой набор веществ и в таких пропорциях, которые обеспечивают деление, рост и дифференциацию размножаемой растительной ткани. Универсальной питательной среды, пригодной для успешного выращивания любого вида растений из любой ткани, нет. В литературе дано много рецептов питательных сред. Примеры:среда Баркхолдера и Никеля, среда Брукса и Хауфа и др.

Раствор добавляют к средам в количестве от нескольких капель до 1мл на 1 л.

Питательная среда состоит из раствора минеральных солей, раствора микроэлементов и различных добавок. Компоненты питательной среды и сами среды готовят на бидистиллированной воде.

Питательную среду готовят в день стерилизации. Берут 0,3-2% агар на бидистиллированной воде. Для этого используются обычный агар. Пластины агара тщательно промывают в течение нескольких часов, сначала в проточной водопроводной, затем в дистиллированной воде и просушивают при комнатной температуре. К раствору агара приливают растворы минеральных солей. pH питательной среды определяют перед автоклонированием. Обычно пользуются средами с pH = 5,5-6,0. питательную среду разливают в пастеризованные пробирки (по 3-5 мл), закрывают ватными пробками и стерилизуют в автоклаве или текучим паром. Если среда не изменяется под действинм высокой температуры, то ее стерилизуют в автоклаве при давлении 0,75 атм. Температуре 115 С в течение 20-30 минут. Чтобы пробки не промокали, перед автоклонированием их закрывают пергаментной бумагой и обвязывают. Если среда изменяется под давлением, ее стерилизуют в кипятильнике. Коха или в автоклаве при температуре 100 С в течение часа. Стерилизация повторяется 3 раза, через 20-24 часа.

Если вещества среды разрушаются при высокой температуре, то применяется холодная стерилизация с применением бактериальных фильтров. Твердые частички из среды перед стерилизацией удаляют центрифугированием и путем фильтрации через бумажные фильтры. В основную среду, охлажденную до 50-60 С, вносят другие экстракты и добавки, стерилизованные холодным способом. Долго хранить среду нежелательно.

В культуре тканей, как отмечалось выше, могут быть использованы зародыши семян и корешки проростков. В любом случае семена стерилизуют, предварительно удалив твердые покровы. Семена обмывают мыльной пеной, горячей водой, споласкивают несколько раз водопроводной, затем дистиллированной водой, обрабатывают стерилизующим веществом и промывают стерильной водой.

Если в культуре используются корешки от проростков, то стерилизованные семена помещают на питательную среду, проращивают при определенной температуре (как правило, оптимальная температура составляет 20-27 С), отрезают кончик появившегося корешка (длиной около 1 см) и пересаживают на питательную среду.

Для выращивания в культуре зародышей семена надрезают или подрезают в халазальной части, зародыши осторожно выдавливают или извлекают шпателем и переносят на питательную среду. При работе с любыми растительными объектами необходимо пользоваться инструментами. Их стерилизуют в боксе путем обработки спиртом и последующего обжигания над спиртовкой. Инструмент кладут на стерилизованную бумагу, нарезанную кусочками. После извлечения зародыша остатки семени и бумаги выбрасывают. Повреждения зародыша при извлечении нежелательны, так как они отрицательно влияют на его рост в культуре

Извлеченные зародыши пересаживают на питательную среду так, чтобы они оказались в центре пробирки или колбы под небольшим слоем среды. Пальцами прикасаться к зародышу нельзя.

Части листа предварительно промывают теплой водой с мылом и стерилизуют.

Отрезки побегов стерилизуют, как правило, спиртом, обжигают над спиртовкой, снимают кору, разрезают на кусочки, которые пересаживают на питательную среду. Как показали исследования, ориентация образцов побегов верхним концом вниз или вверх не влияет на интенсивность каллюсообразования.

Нежные ткани пыльников обрабатываются слабыми растворами стерилизаторов и переносят на питательную среду.

Для успешного роста тканей в изолированной культуре необходимо создать благоприятный температурный, световой режим, а также режим влажности.

Тепловой режим зависит от вида растения и культивируемой ткани. Оптимальной температурой для культуры корней составляет у двудольных 25-27 С у однодольных 20-25С, голосеменных 18-20 С. Культура зародышей успешна при 25-30 С, но на определенном этапе роста она требует обработки пониженными температурами в пределах 1-10 С.

Свет не всегда является необходимым при выращивании культур in vitro. В частности, в темноте можно выращивать непрерывно или фрагментарно культуру корней, свет не требуется на стадии каллюсообразования.

Практически на всех этапах работы методом культуры ткани требуется относительная влажность воздуха около 80%.

Применительно к большинству видов древесных растений основной практической задачей культуры тканей является выращивание жизнеспособных растений, вовлекаемых в дальнейший селекционный процесс или непосредственно используемых в производстве. Для этого необходимо перевести растение из условий стерильной изолированной культуры в условия открытого грунта. Осуществляется это путем укоренения придвточных побегов, образовавшихся в культуре in vitro, и последующего ступенчатого переноса их в грунт или путем прививки.

Для укоренения образовавшихся в культуре in vitro придаточных побегов последние (опять-таки в культуре in vitro) пересаживают на питательную среду с добавлением нафтил- или индолилуксусной кислоты.

Укоренившийся побег пересаживают в вазон с почвой или пеской, предварительно проавтоклавировав их. В течение 5-6 дней растение поливают стерильной водой (если оно высажено в почву) или стерильным питательным раствором (если оно высажено в песок).

Когда растения достигают хорошего развития, их пересаживают в открытый грунт. Одни авторы рекомендуют высаживать растения в грунт вместе с частью питательной среды, а другие – отмывать среду с корней стерильной водой, полагая, что питательная среда будет содействовать развитию патогенных микробов, которые могут погубить растение. Пока этот вопрос не имеет однозначного решения.

Второй путь переноса растений из изолированной культуры в грунт заключается в прививке части придаточного побега или проростка (из зародыша) на подвой. Во избежание отрицательного воздействия резкой смены условий выращивания желательно прививать в условиях теплицы.

Дата добавления: 2015-07-10