Материал и методы исследования. Нами обследовано 126 первичных доноров (73 мужчин и 53 женщин в возрасте 20–57 лет) крови

Нами обследовано 126 первичных доноров (73 мужчин и 53 женщин в возрасте 20–57 лет) крови. Определение общего, тромбоцитарного и свободного СН проводили по методике С. В. Выдыборец и соавт. (2006), а подготовку плазмы к исследованию осуществляли по методике [2]. Плазму, обогащенную тромбоцитами, получали по методике [1], используя в качестве стабилизатора 3,8 % раствор цитрата натрия. Проводили определение содержания общего СН в плазме крови богатой тромбоцитами, и свободный СН в плазме крови, бедной тромбоцитами (после осаждения тромбоцитов). Для получения свободной фракции СН навеску высушенной до постоянного веса при 60 °С плазмы крови, обедненной тромбоцитами, например, 50–100 мг, экстрагировали 0,1 н раствором хлористоводородной кислоты при 4 °С в течение суток. Полученная кислотно-экстрагируемая фракция СН является физиологически активной и обеспечивает проявление его физиологических и патологических эффектов. Мы проводили также определение содержание СН в тромбоцитах после их осаждения из плазмы и полного разрушения. К осадку тромбоцитов добавляли 1 мл бидистиллированной воды, тщательно перемешивали стеклянной палочкой, затем приливали 1 мл 10 % раствора трихлоруксусной кислоты для разрушения тромбоцитов и осаждения белков, снова перемешивали и центрифугировали при 1500 об./мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость, содержащую высвобожденный из тромбоцитов СН, вносили в химические пробирки, добавляли 0,2 мл 0,1 % раствора L-цистеина в 0,1 н соляной кислоте и 1,8 мл 0,1 % раствора ортофталевого альдегида в метаноле. В пробирки вносили по 0,1 мл 0,1 М раствора нингидрина (контроль рН 7,0), пробы выдерживали 10 мин на кипящей водяной бане, затем охлаждали в течение часа (время необходимое для образования флюорофора. Обьем всех проб доводили до 5 мл бидистиллированой водой. В качестве стандарта использовали 0,5 мкг СН совмещенного в одной пробирке с 0,5 н. раствором хлорной кислоты и проведенного через все этапы определения. Контролем реактивов являлись 2 мл раствора хлорной кислоты проведенной через все этапы определения.

Содержание СН определяли относительно стандартов на флюориметре «БИАН-130» — «БИАН-100» при длине волны возбуждения флюоресценции 365 нм и максимуме индуцированной флюоресценции 490 нм. Расчет количественного содержания СН в пробе вели по формуле:

А =	С × Фоп × Р × 1000 × 1000	,
Фст × 176 × В × 2

где: А — количество СН в нмоль/г; С — концентрация стандарта; Фоп — флюоресценция опытной пробы (разность показаний опытной пробы и контроля реактивов); Р — разведение субстрата; 1000 — коэффициент пересчета мкмоль в нмоль; 1000 — коэффициент пересчета количества мг на 1 г навески; Фст — флюоресценция стандарта (разность показаний стандарта и контроля реактивов); 176 — молекулярный вес серотонина; В — вес пробы в мг; 2 — количество мл безбелкового экстракта субстрата.

Для оценки депонирующей способности тромбоцитов количество СН в 1 тромбоците рассчитывали по следующей формуле:

Тс =

(Ст: Т)×1012 амоль

,

Тс — содержание СН в 1 тромбоците в амоль; Ст — содержание СН, связанного с тромбоцитами в нмоль/г; Т — количество тромбоцитов в 1 л плазмы.

Результаты исследований обрабатывали методами вариационной статистики.

Дата добавления: 2015-10-28