Очистка і концентрація гіперімунних антитоксичних сироваток коней.

Антитоксичну гіперімунну плазму коней отримують методом сепарування крові, яка містить 0,35% цитрату натрію. Вихід плазми становить 68-73%.

При гіперімунізації тварин у сироватці їх крові підвищується вміст глобулінів і знижується відносний вміст альбумінів. В антитоксичній сироватці вміст альбумінів становить не більше 30-35%.

Найважливішою складовою частиною сироватки крові є білки, вміст яких в нормі становить 6,5-8,5%. Основна маса білків сироватки – це альбуміни і глобуліни. Альбуміни становлять більше 50% загальної кількості сироваткових білків, глобуліни – близько 40%. Активність антитіл встановлена лише у глобуліновій фракції сироватки.

Білки, які синтезуються в організмі у відповідь на антигенне подразнення і які володіють активністю антитіл, називають імуноглобулінами.

Сьогодні неможливо здійснити селективний відбір якого-небудь певного виду антитіл при імунізації тварин. Проте на тип імунологічної відповіді коней і на переважний синтез певного класу антитіл можуть впливати антигенна стимуляція, хімічна природа антигенних детермінант, тривалість інтервалів між серіями ін'єкцій, склад ад'юванта і навіть спосіб введення антигену. На властивість синтезованих антитіл має вплив також тривалість гіперімунізації коней.

Антитіла, які синтезуються в організмі коней, неоднорідні і являють собою імуноглобуліни, які розподілені серед білків всіх фракцій сироваткових імуноглобулінів.

З метою видалення неактивних білків, підвищення ефективності антитоксичних сироваток і отримання препаратів з високим вмістом специфічних антитіл застосовують методи очищення і концентрування.

Перші виробничі методи очищення сироваток заключались у висолюванні глобулінової фракції сульфатом амонію і наступним очищенням від неактивних білків й іонів солей. Найбільш досконалим серед них вважався метод електроосмосу (електродіалізу).

Методи фракційного очищення сироваток за допомогою солей або неорганічних розчинників призводили до видалення частини баластних білків і виділення антитоксичних білкових фракцій без порушення будови білкової молекули імуноглобулінів, що дозволяло значно зменшити дозу введеного білка. Проте реактогенність таких сироваток була дуже високою. Частота сироваткової хвороби була на тому ж рівні, як і при застосуванні нативних сироваток.

Значне підвищення ступеня очищення і зниження реактогенності антитоксичних сироваток було досягнуто лише при застосуванні методів очищення і концентрування, які включали стадію протеолізу сироваткових білків. У 1936р. був розроблений перший виробничий метод з використанням пепсину для ферментативного розщеплення сироваткових білків при рН 4,0-4,5, наступного висолювання ферментованих антитоксичних глобулінів і видалення баластних речовин за допомогою сорбенту.

У наш час найбільше поширення отримали комбіновані методи, які включають стадії ферментативного гідролізу, нагрівання ферментативних сироваток в кислому середовищі, сольового фракціонування і додаткового очищення від неактивних білків за допомогою органічних розчинників, сорбентів або тривалого їх витримування при низькій температурі.

Методи, які застосовують, відрізняються за умовами протеолізу і способами очищення антитоксину від неактивних білкових фракцій і внесеного ферменту.

З 1955р. виготовлення антитоксичних сироваток коней здійснювалось за методом Діаферм – 3. Завдяки простоті і досить високій ефективності (діаліз-ферментація) отримав широке визнання і в наш час застосовується при виготовленні лікувальних сироваток у світі. Недостатньо високий ступінь очищення сироваток від неактивних білків виступає причиною їх високої реактогенності, а неповне видалення активного пепсину призводить до падіння титру антитіл при зберігання сироваток за рахунок тривалої дії ферменту.

Метод Діаферм – 3 включає стадії ферментативного гідролізу сироваткових білків пепсином протягом 1год при рН 3,2 і 1год при рН 4,2 при 22-24⁰С, термоденатурації (45хв при рН 4,3 і 58⁰С в присутності 14-14,5% сульфату амонію), висолювання активних глобулінів сульфатом амонію (34%) при рН 7,1 діалізу і додаткового очищення діалізату від баластних білків в їх ізоелектричній точці при рН 5,2-5,6 у присутності хлороформу. Тривалість технологічного процесу 6 днів.

Для стабілізації властивостей очищенні сироватки витримують протягом 3міс, після чого у випадку необхідності повторно фільтрують. Як правило, це відноситься до протидифтерійної і сироватки проти ботулізму деяких типів (В, Е і ABCDE), агрегатний стан яких під час зберігання змінюється (утворюється помутніння, осад).

В якості вихідної сировини для виготовлення очищених сироваток може виступати нативна сироватка або плазма. Найкращі очищенні сироватки мають солом'яно-жовтий колір, стійкі фізичні властивості і містять мало баластних речовин.

Висолювання глобулінів, ферментативний гідроліз, прогрівання і виділення основної антитоксичної фракції проводять в реакторах із нержавіючої сталі, які містять кожух для обігріву й мішалки зі швидкістю обертання не більше 60 об/хв. Для відокремлення білкового осаду на першій і другій стадіях очищення застосовують фільтрацію через технічне полотно на касетних фільтрах з наступним віджимом осаду на гідравлічному пресі для більш повного видалення надосадової рідини. Діаліз проводять у ваннах з нержавіючої сталі проти потоку холодної води, яку попередньо очищують від завислих і колоїдних частинок фільтрацією через товстий шар скловолокна і вугілля. Сульфат амонію перед застосуванням подрібнюють, висушують в сушильних шафах і стерилізують в автоклаві. Прання фільтрів з технічного полотна проводять на пральних машинах барабанного типу з віджиманням на центрифугах. Все дрібне обладнання повинне бути емальованим або з нержавіючої сталі.

Очищені і концентровані антитоксичні сироватки містять основну білкову фракцію, яка розміщується в зоні рухливості γ - β₂ (Т-глобулінів), в якій концентрується до 90% антитоксину, і 1-2 додаткові білкові фракції з рухливістю α-глобулінів.

Для отримання сироваткових препаратів з більш високою питомою активністю в наш час є 3 напрями:

1. Пошук способів додаткового очищення сироваток, виготовлених за допомогою методу Діаферм-3;

2. Отримання препаратів «чистих антитіл» методами специфічної сорбції із застосуванням імуносорбентів;

3. Створення удосконалених схем неспецифічного очищення антитоксичних глобулінів на основі використання сорбентів та іонітів.

Для додаткового очищення антитоксичних сироваток, виготовлених методом Діаферм – 3, від баластних β₁- і α₂- глобулінових білкових фракцій, які являють собою найбільш макромолекулярну, лабільну і антигенну частину сироваткових глобулінів, застосовують методи повторного висолювання активних білків, гель-фільтрації й іонного обміну або додаткове оброблення сироваток сорбентами.

Додаткова обробка сироваток виготовлених методом Діаферм – 3, дозволяє дещо покращити їх якість, але супроводжується значними втратами активного білка, подовжує і ускладнює технологічний процес очищення і концентрування.

В останні роки дослідники звернулись до методів виділення антитіл і відокремлення їх від інших білків сироватки крові за допомогою специфічної їх сорбції на антигенах, фіксованих на нерозчинних носіях – імуносорбентах. Таким шляхом неактивні сироваткові білки вдається відокремити від антитіл за один прийом. Цей метод здається досить багатообіцяючим завдяки специфічності, але його використання для отримання високоочищених антитоксичних сироваток у виробничих умовах вимагає додаткових досліджень, спрямованих на розробку виробничих методів отримання імуносорбентів і технології очищення з метою підвищення виходу антитіл і зниження реактогенності готового препарату.

Дата добавления: 2015-10-02