Студопедия
Случайная страница | ТОМ-1 | ТОМ-2 | ТОМ-3
АрхитектураБиологияГеографияДругоеИностранные языки
ИнформатикаИсторияКультураЛитератураМатематика
МедицинаМеханикаОбразованиеОхрана трудаПедагогика
ПолитикаПравоПрограммированиеПсихологияРелигия
СоциологияСпортСтроительствоФизикаФилософия
ФинансыХимияЭкологияЭкономикаЭлектроника

Очистка і концентрація гіперімунних антитоксичних сироваток коней.

Читайте также:
  1. Аэробная очистка сточных вод гидролизного производства
  2. Методы выделения жиров из сырья, их очистка
  3. Очистка мышц
  4. Очистка последрожжевой бражки на биоокислителях
  5. Очистка сточных вод
  6. Очистка сточных вод активным илом

Антитоксичну гіперімунну плазму коней отримують методом сепарування крові, яка містить 0,35% цитрату натрію. Вихід плазми становить 68-73%.

При гіперімунізації тварин у сироватці їх крові підвищується вміст глобулінів і знижується відносний вміст альбумінів. В антитоксичній сироватці вміст альбумінів становить не більше 30-35%.

Найважливішою складовою частиною сироватки крові є білки, вміст яких в нормі становить 6,5-8,5%. Основна маса білків сироватки – це альбуміни і глобуліни. Альбуміни становлять більше 50% загальної кількості сироваткових білків, глобуліни – близько 40%. Активність антитіл встановлена лише у глобуліновій фракції сироватки.

Білки, які синтезуються в організмі у відповідь на антигенне подразнення і які володіють активністю антитіл, називають імуноглобулінами.

Сьогодні неможливо здійснити селективний відбір якого-небудь певного виду антитіл при імунізації тварин. Проте на тип імунологічної відповіді коней і на переважний синтез певного класу антитіл можуть впливати антигенна стимуляція, хімічна природа антигенних детермінант, тривалість інтервалів між серіями ін'єкцій, склад ад'юванта і навіть спосіб введення антигену. На властивість синтезованих антитіл має вплив також тривалість гіперімунізації коней.

Антитіла, які синтезуються в організмі коней, неоднорідні і являють собою імуноглобуліни, які розподілені серед білків всіх фракцій сироваткових імуноглобулінів.

З метою видалення неактивних білків, підвищення ефективності антитоксичних сироваток і отримання препаратів з високим вмістом специфічних антитіл застосовують методи очищення і концентрування.

Перші виробничі методи очищення сироваток заключались у висолюванні глобулінової фракції сульфатом амонію і наступним очищенням від неактивних білків й іонів солей. Найбільш досконалим серед них вважався метод електроосмосу (електродіалізу).

Методи фракційного очищення сироваток за допомогою солей або неорганічних розчинників призводили до видалення частини баластних білків і виділення антитоксичних білкових фракцій без порушення будови білкової молекули імуноглобулінів, що дозволяло значно зменшити дозу введеного білка. Проте реактогенність таких сироваток була дуже високою. Частота сироваткової хвороби була на тому ж рівні, як і при застосуванні нативних сироваток.

Значне підвищення ступеня очищення і зниження реактогенності антитоксичних сироваток було досягнуто лише при застосуванні методів очищення і концентрування, які включали стадію протеолізу сироваткових білків. У 1936р. був розроблений перший виробничий метод з використанням пепсину для ферментативного розщеплення сироваткових білків при рН 4,0-4,5, наступного висолювання ферментованих антитоксичних глобулінів і видалення баластних речовин за допомогою сорбенту.

У наш час найбільше поширення отримали комбіновані методи, які включають стадії ферментативного гідролізу, нагрівання ферментативних сироваток в кислому середовищі, сольового фракціонування і додаткового очищення від неактивних білків за допомогою органічних розчинників, сорбентів або тривалого їх витримування при низькій температурі.

Методи, які застосовують, відрізняються за умовами протеолізу і способами очищення антитоксину від неактивних білкових фракцій і внесеного ферменту.

З 1955р. виготовлення антитоксичних сироваток коней здійснювалось за методом Діаферм – 3. Завдяки простоті і досить високій ефективності (діаліз-ферментація) отримав широке визнання і в наш час застосовується при виготовленні лікувальних сироваток у світі. Недостатньо високий ступінь очищення сироваток від неактивних білків виступає причиною їх високої реактогенності, а неповне видалення активного пепсину призводить до падіння титру антитіл при зберігання сироваток за рахунок тривалої дії ферменту.

Метод Діаферм – 3 включає стадії ферментативного гідролізу сироваткових білків пепсином протягом 1год при рН 3,2 і 1год при рН 4,2 при 22-240С, термоденатурації (45хв при рН 4,3 і 580С в присутності 14-14,5% сульфату амонію), висолювання активних глобулінів сульфатом амонію (34%) при рН 7,1 діалізу і додаткового очищення діалізату від баластних білків в їх ізоелектричній точці при рН 5,2-5,6 у присутності хлороформу. Тривалість технологічного процесу 6 днів.

Для стабілізації властивостей очищенні сироватки витримують протягом 3міс, після чого у випадку необхідності повторно фільтрують. Як правило, це відноситься до протидифтерійної і сироватки проти ботулізму деяких типів (В, Е і ABCDE), агрегатний стан яких під час зберігання змінюється (утворюється помутніння, осад).

В якості вихідної сировини для виготовлення очищених сироваток може виступати нативна сироватка або плазма. Найкращі очищенні сироватки мають солом'яно-жовтий колір, стійкі фізичні властивості і містять мало баластних речовин.

 

Висолювання глобулінів, ферментативний гідроліз, прогрівання і виділення основної антитоксичної фракції проводять в реакторах із нержавіючої сталі, які містять кожух для обігріву й мішалки зі швидкістю обертання не більше 60 об/хв. Для відокремлення білкового осаду на першій і другій стадіях очищення застосовують фільтрацію через технічне полотно на касетних фільтрах з наступним віджимом осаду на гідравлічному пресі для більш повного видалення надосадової рідини. Діаліз проводять у ваннах з нержавіючої сталі проти потоку холодної води, яку попередньо очищують від завислих і колоїдних частинок фільтрацією через товстий шар скловолокна і вугілля. Сульфат амонію перед застосуванням подрібнюють, висушують в сушильних шафах і стерилізують в автоклаві. Прання фільтрів з технічного полотна проводять на пральних машинах барабанного типу з віджиманням на центрифугах. Все дрібне обладнання повинне бути емальованим або з нержавіючої сталі.

Очищені і концентровані антитоксичні сироватки містять основну білкову фракцію, яка розміщується в зоні рухливості γ - β2 (Т-глобулінів), в якій концентрується до 90% антитоксину, і 1-2 додаткові білкові фракції з рухливістю α-глобулінів.

 

Для отримання сироваткових препаратів з більш високою питомою активністю в наш час є 3 напрями:

1. Пошук способів додаткового очищення сироваток, виготовлених за допомогою методу Діаферм-3;

2. Отримання препаратів «чистих антитіл» методами специфічної сорбції із застосуванням імуносорбентів;

3. Створення удосконалених схем неспецифічного очищення антитоксичних глобулінів на основі використання сорбентів та іонітів.

Для додаткового очищення антитоксичних сироваток, виготовлених методом Діаферм – 3, від баластних β1- і α2- глобулінових білкових фракцій, які являють собою найбільш макромолекулярну, лабільну і антигенну частину сироваткових глобулінів, застосовують методи повторного висолювання активних білків, гель-фільтрації й іонного обміну або додаткове оброблення сироваток сорбентами.

Додаткова обробка сироваток виготовлених методом Діаферм – 3, дозволяє дещо покращити їх якість, але супроводжується значними втратами активного білка, подовжує і ускладнює технологічний процес очищення і концентрування.

В останні роки дослідники звернулись до методів виділення антитіл і відокремлення їх від інших білків сироватки крові за допомогою специфічної їх сорбції на антигенах, фіксованих на нерозчинних носіях – імуносорбентах. Таким шляхом неактивні сироваткові білки вдається відокремити від антитіл за один прийом. Цей метод здається досить багатообіцяючим завдяки специфічності, але його використання для отримання високоочищених антитоксичних сироваток у виробничих умовах вимагає додаткових досліджень, спрямованих на розробку виробничих методів отримання імуносорбентів і технології очищення з метою підвищення виходу антитіл і зниження реактогенності готового препарату.


Дата добавления: 2015-10-02; просмотров: 155 | Нарушение авторских прав


<== предыдущая страница | следующая страница ==>
Первая помощь при несчастных случаях| Задание

mybiblioteka.su - 2015-2024 год. (0.007 сек.)