Методы выделения чистых культур, основанные на биологическом принципе

Биологический принцип разъединения бактерий предусматривает целеустремленный поиск методов, которые учитывают многочисленные особенности микробных клеток. Среди самых распространенных методов можно выделить следующие:

1. По типу дыхания. Все микроорганизмы по типу дыхания разделяются на две основных группы: аэробные (Corynebacterium diphtheriae, Vibrio сholerae и тому подобное) и анаэробные (Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens и др.). Если материал, из которого следует выделить анаэробные возбудители, предварительно прогреть, а затем культивировать в анаэробных условиях, то вырастут именно эти бактерии.

2. По спорообразованию. Известно, что некоторые микробы (бациллы и клостридии) способны к споротворення. Среди них Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Bacillus subtilis, Bacillus cereus. Споры стойкие к действию факторов внешней среды. Следовательно, исследуемый материал может быть подданный действию термического фактора, а затем инокулятивно перенесен в питательную среду. Спустя некоторое время на нем вырастут именно те бактерии, которые способны к споротворению.

3. Стойкость микробов к действию кислот и щелочей. Некоторые микробы (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis) в результате особенностей их химического строения стойки к действию кислот. Вот почему материал, который их содержит, например, мокрота при туберкулезе предварительно обрабатывают равным объемом 10 % раствора серной кислоты, а затем высевают на питательные среды. Посторонняя флора погибает, а микобактерии в результате их резистентности к кислотам, вырастают.

Холерный вибрион (Vibrio сholerae), напротив, является галофильной бактерией, потому для создания оптимальных условий роста его высевают на среды, которые содержат щелочь (1 % щелочная пептонная вода). Уже через 4-6 часов на поверхности среды появляются характерные признаки роста в виде нежной голубоватой пленки.

4. Подвижность бактерий. Некоторые микробы (Proteus vulgaris) имеют тенденцию к ползучему росту и способны быстро распространяться по поверхности кое-что влажной среды. Для выделения таких возбудителей их засевают в капельку конденсационной жидкости, которая образуется при охлаждении столбика скошенного агара. Через 16-18 год они распространяются на всю поверхность среды. Если взять материал из верхней части агара, будем иметь чистую культуру возбудителей.

5. Чувствительность микробов к действию химических веществ, антибиотиков и других противомикробных средств. В результате особенностей метаболизма бактерий они могут иметь разную чувствительность к некоторым химическим факторам. Известно, что стафилококки, аэробные бациллы, которые образуют споры, стойкие к действию 7,5–10 % хлорида натрия. Вот почему для выделения этих возбудителей используют элективные питательные среды (желточно-солевой агар, манит-солевой агар), которые содержат именно это вещество. Другие бактерии при такой концентрации хлорида натрия практически не растут.

6. Введение некоторых антибиотиков (нистатин) используется для торможения роста грибов в материале, который сильно контаминированный ими. И, напротив, добавление антибиотика пеницилина к среде способствует росту бактериальной флоры, если нужно выделить грибы. Добавление фуразолидона в определенных концентрациях к питательной среде создает селективные условия для роста коринебактерий и микрококков.

7. Способность микроорганизмов проникать через неповрежденные кожные покровы. Некоторые патогенные бактерии (Yersinia pestis) в результате наличия большого количества ферментов агрессии способны проникать через неповрежденную кожу. Для этого шерсть на теле лабораторного животного бреют и в этот участок втирают исследуемый материал, который содержит возбудителя и большое количество сторонней микрофлоры. Через некоторое время животное забивают, а из крови или внутренних органов выделяют микробов.

8. Чувствительность лабораторных животных к возбудителям инфекционных заболеваний. Отдельные животные проявляют высокую чувствительность к разным микроорганизмам.

Например, при любом способе введения Streptococcus pneumoniae белым мышам у них развивается генерализованная пневмококковая инфекция. Аналогичная картина наблюдается при заражении гвинейских свинок возбудителями туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis).

В повседневной практике бактериологи пользуются такими понятиями как штамм и чистая культура микроорганизмов. Под штаммом понимают микробов одного вида, которые выделены из разных источников, или из одного и того же источника, но в разное время. Чистая культура бактерий – это микроорганизмы одного вида, потомки одной микробной клетки, которые выросли на (в) питательной среде.

Выделение чистой культуры аеробних микроорганизмов состоит из ряда этапов.

В первый день (1 этап исследования) в стерильную посуду (пробирка, колба, флакон) забирают патологический материал. Его изучают - внешний вид, консистенция, цвет, запах и другие признаки, готовят мазок, красят и исследуют под микроскопом. В некоторых случаях (острая гонорея, чума) на этом этапе можно поставить предварительный диагноз, а кроме того, подобрать среды, на которые будет засеваться материал. Затем проводят бактериологической петлей (применяется чаще всего), с помощью шпателя - методом Дригальского, ватно-марлевым тампоном. Чашки закрывают, переворачивают вверх дном, подписывают специальным карандашом и ставят в термостат при оптимальной температуре (37 °С) на 18-48 часов. Цель этапа – получить изолированные колонии микроорганизмов.

Однако, порой с целью нагромождения материала его засевают на жидкие питательные среды.

На второй день (2 этап исследования) на поверхности плотной питательной среды микроорганизмы образуют сплошной, густой рост или изолированные колонии. Колония – это видимые невооруженным глазом скопления бактерий на поверхности или в толще питательной среды. Как правило, каждая колония формируется из потомков одной микробной клетки (клоны), потому их состав достаточно однороден. Особенности роста бактерий на питательных средах являются проявлением их культуральных свойств.

Чашки тщательным образом рассматривают и изучают изолированные колонии, которые выросли на поверхности агара. Обращают внимание на величину, форму, цвет, характер краев и поверхности колоний, их консистенцию и другие признаки. Если требуется, исследуют колонии под лупой, малым или большим увеличением микроскопа. Структуру колоний исследуют в проходном свете при малом увеличении микроскопа. Они могут быть гиалиновые, зернистые, нитевидные или волокнистые, которые характеризуются наличием переплетенных нитей в толще колоний.

Характеристика колоний – важна составная часть работы бактериолога и лаборанта, ведь микроорганизмам каждого вида присущи свои особенные колонии.

На третий день (3 этап исследования) изучают характер роста чистой культуры микроорганизмов и проводят ее идентификацию.

Сначала обращают внимание на особенности роста микроорганизмов на среде и делают мазок, крася его методом Грама, с целью проверки культуры на чистоту. Если под микроскопом наблюдают бактерии однотипной морфологии, размером и тинкториальных (способность краситься) свойств, делают вывод, что культура чиста. В некоторых случаях уже по внешнему виду и особенностям их роста можно сделать вывод о виде выделенных возбудителей. Определение вида бактерий по их морфологическим признакам называется морфологической идентификацией. Определения вида возбудителей по их культуральным признакам называют культуральной идентификацией.

Однако этих исследований недостаточно, чтобы сделать окончательный вывод о виде выделенных микробов. Потому изучают биохимические свойства бактерий. Они достаточно разнообразны.

Дата добавления: 2015-08-20