Экспериментальная часть. Техника периодического культивирования микроорганизмов включает следующие

Техника периодического культивирования микроорганизмов включает следующие операции:

1. Подготовка основной питательной среды

Состав основной питательной среды для выращивания на углеводах (г/л): глюкоза - 10,0; (NH₄)₂SO₄ - 3,5; NH₄H₂PO₄ - 0,8; КСl -0,5; MgSO₄ ·7H₂O - 0,25; FeSO₄ - 0,15; ZnSO₄ - 0,015; MnSO₄ - 0,01; дрожжевой автолизат - 1 мл.

Подготовленная питательная среда разливается по 100 мл в конические качалочные колбы и стерилизуется при давлении 0,5 атм в течение 20 мин.

2. Подготовка питательной среды с использованием отходов производства

К 150 г мелассы или какого-либо другого отхода пищевой промышленности прибавляют при помешивании 0,9 мл H₂SO₄ (r=1,84). Затем не прекращая размешивания, насыпают 1,5 г суперфосфата, добавляют еще 200 мл водопроводной воды, размешивают в течение 20-30 мин и выливают в высокий цилиндр (объемом 500 мл). Через 10-12 ч (на следующий день) отстоявшуюся массу мелассы декантируют, суспензию фильтруют и фильтрат присоединяют к общему объему. Осветленную мелассу доводят водой до объема 600 мл. Отдельно готовят раствор питательных солей.

К 7 г суперфосфата добавляют 80 мл воды, размешивают, кипятят 5 мин, охлаждают, отстаивают и фильтруют. Осадок на фильтре промывают так, чтобы общий объем составил 100 мл.

Готовят 260 мл 3,25%-ного раствора сернокислого аммония, кипятят 5 мин и фильтруют теплый раствор (при необходимости).

3. Выявление посторонних микроорганизмов в маточных дрожжах.

Степень засоренности чистой культуры (засевных дрожжей) дикими дрожжевыми грибками оценивают при помощи элективной ацетатной среды (ацетатный буферный раствор с рН=4,5-5), где имеются благоприятные условия для размножения диких дрожжей, а сахаромицеты не размножаются.

1-2 капли взвеси засевных прессованных дрожжей вносят в пробирку с ацетатной средой (5-10 мл). Посев производят с соблюдением всех правил асептики – над пламенем горелки, стерильной пипеткой или прокаленной петлей.

Засеянную пробирку помещают в термостат при температуре 30⁰ С и ведут за ней ежедневные наблюдения. Появление пленки на поверхности среды или ее помутнение указывает на наличие посторонних дрожжевых грибков. Если это явление произойдет через 1-2 дня, то дрожжи не пригодны для работы по удлиненным циклам, если через 3-4 дня – дрожжи удовлетворительные, а если через 5 и более дней – культура чистая. Более точно степень засоренности культуры определяют методом микрокультуры или методом высева на чашки Петри.

4. Подготовка инокулята (засевного материала)

Чистые культуры дрожжей и бактерий выращиваются соответственно на твердой питательной среде (косяки), сусло-агаре и МПА (мясопептонный агар) в течение 48 ч при температуре соответственно 32 -34 и 37-38° С. Выросшие культуры засевают в жидкие питательные среды и выращивают на качалке в течение 24 ч. Выросшие культуры используются в качестве посевного материала.

5. Засев подготовленной питательной среды на углеводах

Измеряют на фотоэлектроколориметре величину светорассеяния суспензии выросших культур, используемых в качестве инокулята.

Питательная среда для микроорганизмов, в которой предполагается определять биомассу по светорассеянию, должна быть оптически прозрачной. Если помутнение среды связано с выпадением в осадок солей, чаще всего фосфатов, то перед измерением светорассеяния среду подкисляют несколькими каплями концентрированной соляной кислоты.

Для измерения светорассеяния выбирают светофильтр, обеспечивающий максимум пропускания света данной суспензии. Светорассеяние суспензии дрожжей и бактерий в бесцветных средах измеряют с зеленым или сине-зеленым фильтром против воды и выражают в единицах оптической плотности.

При высоких концентрациях клеток в культуральной среде рассеяние света усиливается, что приводит к получению заниженных результатов. Поэтому суспензии с высокой плотностью клеток перед измерением светорассеяния следует разводить средой или водой.

Для исследуемых культур по имеющимся графикам зависимости показаний фотоэлектроколориметра от числа клеток и биомассы, определяют содержание клеток или сухой биомассы в единице объема среды. Засевают подготовленную к опыту питательную среду таким объемом засевной суспензии, чтобы обеспечить в опытной колбе количество засевного материала 0,5% и 1% (в зависимости от варианта опыта).

Инокулят вносят при использовании техники, обеспечивающей стерильность операции.

6. Процесс выращивания дрожжей на отходах производства

В аппарат наливают 100 мл прокипяченной воды, охлажденной до 30-35⁰С, добавляют 8 мл мелассы, 4 мл раствора сернокислого аммония, наливают 2 мл вытяжки суперфосфата, 8 мл свежеактивированных дрожжей, подают воздух для аэрации среды (0,5-1 л/мин) или ставят на качалку,

Схема притока мелассы, солей и воды приведены в табл. 27.

Температуру среды поддерживают в пределах 30-32⁰ С, рН среды – 4,5-5,5, в случае снижения рН до 4 вместо сернокислого аммония добавляют раствор аммиака с массовой долей 0,73 % (0,2 моль/л).

Таблица 27

Схема добавления питательной среды

Среда	Поступление по часам
Меласса, мл
Вытяжка суперфосфата, мл
Раствор (NH4)2SO4, мл
Вода, мл

Пену гасят 2-3 каплями олеиновой кислоты и подсолнечного масла. После опыта полученную бражку с дрожжами выливают из аппарата. Пробу в количестве 100 мл можно отфильтровать через бумагу, не пропускающую дрожжевые клетки. Можно использовать воронку Бюхнера (водоструйный насос). Выделенные дрожжи промывают водой и определяют влажность. В процессе выращивания дрожжей ведут контроль размножения и исследуют условия культивирования.

Дата добавления: 2015-08-10