Выделение свободноживущих азотфиксирующих микроорганизмов

Свободноживущие азотфиксирующие организмы распространены повсеместно и встречаются среди бактерий самых разных таксономических групп, относящихся как к хемотрофам, так и фототрофам к аэробам и анаэробам.

Наиболее хорошо изученным среди свободноживущих аэробных азотфиксирующих бактерий являются бактерии рода Azotobacter.

Azotobacter chroococcum – это соединенные в пары одиночные кокковидные клетки размером 3-7 мкм, в старой культуре клетки обычно окружены слизистой капсулой, а колонии темнеют до темно-серого и темно-коричневого цвета. Активность азотфиксации составляет до 20 мг азота на 1 г потребленного органического вещества.

Наиболее изученными анаэробными свободноживующими азотфиксирующими организмами являются маслянокислые бактерии Clostridium pasteurianum, активность азотфиксации которых достигает до 12 мг азота на 1 г потребленного органического вещества.

Для выделения азотфиксирующих организмов из природных сред используют метод получения накопительных культур на синтетических средах, в которых отсутствуют источники азота. В частности используется среда Эшби, г/л: манит (или глюкоза, или сахароза) – 20; KH₂PO₄ – 0,2; MgSO₄ – 0,2; NaCl – 0,2; K₂SO₄ – 0,1; CaCO₃ -5,0; рН среды 6,0-6,5.

Питательную среду по 30 мл, не стерилизуя, разливают в колбы объемом 100-150 мл и вносят комочек почвы (1/2 чайной ложки), закрывают ватными пробками и термостатируют при 28-30⁰ С.

На 5-6 сутки на поверхности жидкости образуется бурая пленка, при микроскопировании которой обнаруживаются клетки азотобактера в виде кокков и диплококков. Некоторые клетки покрыты слизистой капсулой.

Элективными условиями для азотобактера, способного фиксировать азот атмосферы, являются аэрация, отсутствие в питательной среде азота и присутствие в среде фосфора и кальция, к которым требователен азотобактер.

В некоторых случаях наблюдается вспенивание жидкости в колбе и появление запаха масляной кислоты, что указывает на развитие в среде на дне колбы в анаэробных условиях бактерий Clostridium pasteurianum.

Для изучения морфологии микроорганизмов готовят препараты: один из пленки с поверхности среды для выделения азотобактера (фиксированный препарат, негативно окрашенный тушью); второй из нижних слоев жидкости для выявления клостридий (препарат «раздавленная капля» с добавлением раствора Люголя).

Образование масляной кислоты в среде обнаруживают по реакции с хлорным железом. 5 мл жидкой среды из накопительной культуры переносят в пробирку, добавляют 2 мл 2% раствора хлорнокислого железа и нагревают до кипения. Пары образующегося раствора маслянокислого железа в проходящем свете имеют кроваво-красный цвет.

Дата добавления: 2015-08-10