Методики контроля качества

Определение общей концентрации (густоты) микробных клеток

Пробу нативной культуры в количестве 0,5 мл разводят последовательно 10 кратным количеством 0,9 %-го раствора хлорида натрия. При этом отмечают количество разводок. Разведение проводят до уравнения мутности пробы с мутностью стандарта ГИСК им. Л. А. Тарасевича, определяемое визуально. Расчет концентрации проводят по формуле:

Х = 0,5 ^. 2 ^. 10ⁿ, где n – количество разведений

Определение количества живых микробов в нулевой и конечной пробах

Пробу нативной культуры в количестве 0,5 мл разводят последовательно 10 кратным количеством 0,9 %-го раствора хлорида натрия до 8 разведения (в нулевой пробе – до 7 разведения). Затем в мерную пипетку набирают 0,1 мл культуры и производят посев в чашку Петри с ППС.

Посевы инкубируют в течение 48 ч при температуре (37±1) ⁰ С. По истечение указанного времени проводят подсчет выросших колоний. Расчет концентрации осущетсвляют по формуле:

Х = 0,1 ^. 10 ^. 8ⁿ, где n – количество разведений

ЗАВЕРШЕНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТ НА СТАДИИ

Всю стеклянную посуду, ферментер с остатками нативной культуры и вспомагательные матариалы «загрязненные» культурой стерилизуют в автоклаве при температуре (130 ± 1) ^оС в течение 2 ч.

МИКРОСКОПИЯ ПО ГРАМУ

Подготовка красок

Раствор метилвиолета. 10 г метилвиолета насыпают во флакон с притертой пробкой, наливают 100 мл 96 %-ного этилового спирта и дают этой смеси отстояться (2…3) сут. Раствор периодически (1 раз в день) перемешивают встряхиванием флакона. 10 мл спиртового раствора метилвиолета смешивают с 90 мл 5 %-ного водного раствора карболовой кислоты.

Раствор Люголя. В 10 мл дистиллированной воды растворяют 2 г йодистого калия, затем добавляют 1 г йода кристаллического. После растворения препаратов объем раствора доводят дистиллированной водой до 300 мл.

Карболовый фуксин Циля. 1 г порошка фуксина основного тщательно растирают с 5 г карболовой кислоты в фарфоровой ступке до получения гомогенной смеси, добавив 2…5 капель глицерина. Во время растирания добавляют небольшими порциями 10 мл 96 %-ного этилового спирта. Когда смесь превратится в полужидкую кашицу без комков, добавляют 100 мл дистиллированной воды и перемешивают.

Дают отстояться полученной смеси двое суток, затем фильтруют через один слой фильтровальной бумаги. Раствор хранят в посуде из темного стекла с притертой пробкой в течение 1 года при комнатной температуре.

Рабочий раствор фуксина Пфейфера. К 1 мл карболового фуксина Циля добавляют 9 мл дистиллированной воды. Раствор хранению не подлежит, готовят по мере необходимости.

Проведение анализа

На бумажку наносят раствор метилвиолета на (1…2) мин. Краску с бумажки удаляют и препарат (1…2) мин обрабатывают раствором Люголя до полного почернения мазка. Затем раствор Люголя сливают и на (0,5…1,0) мин наносят 96 %-ный этиловый спирт. Далее мазок промывают дистиллированной водой и окрашивают (1…2) мин рабочим раствором фуксина Пфейфера. После этого краску сливают, препарат промывают водопроводной водой и сушат фильтровальной бумагой. Мазок просматривают под микроскопом с использованием объектива 90х и окуляров 7х. Необходимо просмотреть не менее 50 полей зрения.

МЕТОДИКА ОТБОРА ПРОБЫ

Отбор пробы осуществляется с соблюдением правил асептики. Операция выполняется с соблюдением правила парности. Перед отбором зажечь пламя спиртовки и над пламенем слить остатки микробной культуры в емкость с 5 %-м раствором перекиси водорода. Затем при помощи зажимов Кохера освободить часть трубки от микробной культуры путем ее сильного накручивания на зажимы, расположенные на окончании трубки, и пережать еще одним зажимом. Скрутку отпустить. Ту же операцию провести и на трубке пробоотборника. Над пламенем спиртовки один оператор удерживает сначала трубку от емкости с микробной культурой, а второй – ножницами отрезает у окончания трубки зажимы и убирает их в емкость с дезраствором. Затем второй оператор подает трубку от пробоотборника в руку первому и проводит ту же операцию. Первый соединяет обе трубки через штуцер над пламенем спиртовки. Далее отбирается проба, предварительно освободив трубку от всех зажимов, в необходимом количестве (20…40 см³). Затем трубка пережимается 4-я зажимами с небольшим промежутком между парами. Берутся салфетки, смоченные дезраствором, прокладываются: одна – снизу трубки, вторая – сверху. Между ними помещаются ножницы и перерезают трубку. Салфетки пережимаются на разных концах вторыми (от края) зажимами.

МЕТОДИКА ЗАСЕВА МАТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ

Операция проводится с соблюдением правил асептики и парности в работе. Все присоединения емкости с маточной культурой к аппарату производятся в соответствии с «Методикой отбора проб».

Введение маточной культуры в аппарат можно выполнить путем вакуумирования аппарата, либо путем создания небольшого давления (через редуктор) в емкости с маточной культурой. После введения маточной культуры в аппарат необходимо провести промывку трубок стерильной дистиллированной водой. Все соединения проводятся в соответствии с «Методикой отбора проб». Введение пеногасителя в аппарат производится аналогично вышеописанному.

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ВОДОРОДНЫХ ИОНОВ (рН)

Операция проводится в вытяжном шкафу. Перед определением рН прибор должен быть включен не менее, чем за 15 минут. Необходимо проверить: наличие калия хлористого в электроде; его чистоту, а при наличие пленки – промыть ацетоном или 1 %-ным раствором соляной кислоты. Затем проверить рН-метр по буферному раствору (рН=6,86 ед.рН).

Перед проверкой электроды промыть дистиллированной водой, высушить фильтровальной бумагой. Пробу налить в стаканчик и поставить под электроды. Точные показания будут через 3 минуты. По окончании замера стаканчик убрать из под электродов и поместить в емкость с дезраствором на 3 минуты, затем промыть их дистиллированной водой. Электроды в процессе хранения должны постоянно находиться в дистиллированной воде.

МЕТОДИКА ОКРАСКИ ПО ГРАММУ

Определение проводят в вытяжном шкафу. На предметное стекло наносят 0,1 см³ микробной культуры с помощью пипетки. На предметном стекле равномерно распределяют пробу и оставляют досушиваться в шкафу на воздухе приблизительно на 20 минут. Затем мазок фиксируют над пламенем спиртовки путем 4-5-ти кратным разведением. Далее по методике, описанной в «Методических указаниях» со слов: «На бумажку…».

МЕТОДИКА РАСЧЕТА ПЛОТНОСТИ ПОСЕВА

Для того, чтобы узнать, какое количество посевного материала необходимо ввести в аппарат, необходимо знать:

1 концентрацию приготовленного ПМ, млрд.кл. в см³;

2 объем ЖПС дм³.

Согласно «Методических указаний …» плотность посева должна составлять 400…600 млн. микробных клеток в см³. Расчет необходимого количества МП проводится по следующим формулам:

Спм

С1 = ----------- (1)

Vжпс

ПД

Vпм = --------- (2)

С1

где: С1 – концентрация ПМ после разведения ЖПС, млрд.кл. в см³;

Vжпс – объем питательной среды, дм³;

Спм – концентрация приготовленного ПМ, млрд.кл. в см³;

ПД – необходимая плотность посева, млрд.кл. в см³;

Vпм – объем посевного материала, см³ или дм³.

3. ВОПРОСЫ ПО ТЕМЕ ЗАНЯТИЯ.

1. Стерилизация питательных сред.

2. Методы культивирования, использующиеся в биотехнологической практике.

3. Способы контроля стерильности посевных и нативных культур.

4. Технологические параметры культивирования экспериментального производства колибактерина.

5. Основные элементы конструкции типового аппарата – культиватора.

6. Кривая роста популяции микробов и характеристика фаз процесса периодического культивирования.

7. Математическая модель Н. Д. Иерусалимского.

8. Стерилизация оборудования.

9. Определение густоты микробной взвеси.

10. Определение количества живых микробов.

11. Окраска по Граму.

4. ЛИТЕРАТУРА ПО ТЕМЕ ЗАНЯТИЯ

1. Егорова Т. А. Основы биотехнологии. М.., - 2003.

2. Регламент производства. ПР – 153 – 80. Колибактерин сухой. Утв. 20. 06. 1980.

3. Пименов Е. В., Дармов И. В., Бакулин М. К. Микроорганизмы в биотехнологических производствах. – Киров, 1997.

4. Бакулин М. К. Приготовление питательных сред и подготовка посуды для культивирования микроорганизмов. Виды питательных сред. Техника посева микроорганизмов в жидкие, полужидкие и на плотные питательные среды. – Киров, 1997.

СОДЕРЖАНИЕ

1.	Общие сведения………………………………………………..
	Краткие сведения о колибактерине……………………….
	Способы стерилизации питательных сред……………..
	Способы культивирования микробных клеток…………
	Содержание лабораторного занятия…………………………..
	Цели занятия………………………………………………..
	Сырье, материалы, реактивы и оборудование……………
	Ход работы………………………………………………….
	Вопросы по теме занятия……………………………………….
	Литература по теме занятия…………………………………….

Дата добавления: 2015-07-25