Определение количества вещества в неоднородных объектах методом фотометрирования при двух длинах волн.

Сопоставим однородный и неоднородный объекты при условии, что количество хромофора в обоих случаях одинаково. Для этого введем следующие обозначения:

· S - площадь освещенной поверхности объектов, совпадающая с площадью тестирующего пучка монохроматического излучения;

· J₀ – световой поток, падающий на эту поверхность, выраженный в квантах/секунду;

· m – количество хромофора в объектах, выраженное в молях;

· dm/dS – поверхностная плотность хромафора

В случае однородного объекта

где С и l – концентрация вещества в объекте (количество вещества в единице объема) и толщина объекта. Согласно закону Бугера-Ламберта-Бера:

где К – поверхностный коэффициент поглощения, равный e´10^-3 моль^-1´см²; а J – выходящий из объекта световой поток.

Для неоднородного объекта

При этом вид зависимости dm/dS=f(S) неизвестен.

Разобъем неоднородный объект на такие маленькие фрагменты площадью dS каждый, чтобы неоднородностью распределения хромофора в пределах фрагмента можно было пренебречь. Закон Бугера-Ламберта-Бера в каждом из фрагментов будет выполняться и, соответственно, выходящий из каждого фрагмента световой поток dJ будет равен:

Полный световой поток J’, выходящий из неоднородного объекта площадью S, тогда будет составлять:

Отсюда

Трансформируем последнее уравнение в следующий вид;

Разложим подъинтегральное выражение в ряд Тейлора и будет интегрировать его по частям:

Прологарифмировав последнее уравнение с учетом того, что lg(J₀/J’)=D’ (оптическая плотность неоднородного объекта), а Km/S = D (оптическая плотность однородного объекта), получим:

Из анализа полученного выражения вытекает, во-первых, что оптическая плотность неоднородного объекта всегда меньше, чем оптическая плотность однородного с тем же количеством хромофора, а, во-вторых, что второй член правой части выражения и является отличием неоднородного объекта от однородного, т.е. отражает неоднородность. К сожалению, точно рассчитать численное значение этого члена невозможно, поэтому будем искать приближенные решения.

Измерим D’ при двух длинах волн l₁ и l₂. Введем величину Q=D’(l₂)/D’(l₁) и параметр a=К₂/К₁. Величина Q будет прямо зависеть от степени неоднородности распределения хромофора в объекте. В однородном объекте Q=D’(l₂)/D’(l₁)= К₂/К₁=a. Если же хромофор распределен предельно неоднородно (весь стянут в безразмерную точку с бесконечной концентрацией вещества) Q®1 (эта точка будет одинаково непрозрачна для излучения с любой длиной волны, т.е. поглощение не зависит от К).

Имея две величины D’ можно составить систему уравнений из двух выражений (1). Одно из приближенных решений этой системы уравнений имеет вид:

К сожалению, на практике К₁ и К₂ обычно неизвестны. Но, если необходимо знать не абсолютное количество вещества (массу) хромофора в объекте, а только относительную (т.е. некий показатель, пропорциональный массе, обозначим этот показатель m_отн), то ее можно определить при условии, что величины a в сравниваемых объектах одинаковы и постоянны. Тогда применяется следующее выражение:

где q – параметр, зависящий от Q. В приложении к данной работе приведена таблица для перевода величины Q в значения q (таблица публикуется по работе Шерудило А.И. Определение количества поглощающего свет вещества при цитофотометрии существенно негомогенных объектов. Биофизика, 1968, 13, №4, с. 741-744). На практике данный прием реализуется следующим образом. На спектре поглощения неоднородных объектов выбирают такой участок, чтобы D’(l₁) было меньше 1,2. Измеряют площадь всех сопоставляемых объектов S. Вычисляют для каждого из объектов величины Q, а исходя из них – значения q. Далее подставляют найденные величины в указанное выше уравнение для расчета m_отн. Полученные величины сопоставляют друг с другом, приняв минимальную из них за условную 1 и выразив остальные через нее. Если хотя бы для одного из образцов известны К₂ и К_{1 ,} можно рассчитать и абсолютные содержания исследуемого хромофора во всех объектах.

Уравнение (2) применимо при условии, что

Если величина a точно неизвестна, подбирают такие длины волн тестирующего излучения, чтобы

Этого достаточно, чтобы a оказалась в нужных пределах.

Дата добавления: 2015-07-25