Теоретическое введение

РАБОТА № 2

Спектрофотометрия биологических суспензий на примере эритроцитов

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ВВЕДЕНИЕ

При применении спектрофотометрии для анализа свойств биологических объектов нужно иметь ввиду наличие у этих объектов ряда особенностей, которые, если их не учитывать, могут очень сильно исказить результаты измерений оптической плотности или светопропускания. Одна из таких особенностей – светорассеивание.

Определение: Светорассеиванием называется любое отклонение квантов света в веществе образца от первоначального направления распространения, если переизлучение квантов происходит менее, чем за 10^-12 с.

Светорассеивание связано с оптической неоднородностью объекта, т.е. наличием в нем областей с различными значениями коэффициента преломления света. При прохождении излучением такой области вследствие преломления или отражения направление распространения квантов изменяется – происходит светорассеивание.

Светорассеивание в биологических объектах бывает двух типов:

1. однократное, когда каждый квант в объекте меняет направление своего распространения в объекте не более 1 раза;
2. многократное, когда квант может изменить направление более, чем 1 раз.

Во всех случаях наличие светорассеивания в объекте приводит к завышению измеряемой спектрофотометром оптической плотности объекта (D_и). Это связано с тем, что часть рассеянных квантов отклоняется так сильно, что не попадает на фотодетектор спектрофотометра и не регистрируется. Прибор воспринимает такие кванты как поглощенные объектом, и D_и оказывается завышенной. При регистрации спектра поглощения, поскольку величина светорассеивания зависит от длины волны излучения, степень искажения D_и к тому же будет разной в разных частях регистрируемого спектра. Из-за этого вид спектра поглощения очень сильно искажается, и проведение качественного спектрофотометрического анализа оказывается невозможно.

При многократном светорассеивании накладывается еще один искажающий результаты фотометрии эффект. Дело в том, что при многократном рассеивании квант внутри объекта двигается по ломаной траектории, общая длина которой может оказаться существенно большей, чем толщина кюветы. А поскольку по закону Бугера-Ламберта-Бера величина оптической плотности прямо связана с расстоянием, проходимым квантом в веществе объекта (оптическим путем), а не с толщиной кюветы (как обычно принимается на практике), то при многократном светорассеивании оказывается завышенной и истинная оптическая плотность объекта (D_п), связанная с истинным поглощением.

Таким образом, при наличии в объекте светорассеивания решение качественной и количественной спектрофотометрических задач оказывается сильно затруднено.

Однако, имеется ряд приемов, которые позволяют правильно измерить D_п рассеивающих свет (мутных) объектов.

Дата добавления: 2015-07-25