ПЦР с обратной транскрипцией

В данном случае перед тем или иным вариантом ПЦР производится реакция обратной транскрипции (РНК в ДНК) с использованием фермента ревертазы. Таким образом, этот метод позволяет проводить качественное или количественное обнаружение молекул РНК. Это может использоваться для детекции РНК-содержащих вирусов или определения уровня транскрипции (количества мРНК) того или иного гена.

Рисунок 1. Этапы ПЦР. Красным цветом обозначены праймеры.

Рисунок 2. Накопление двуцепочечных молекул ДНК, ограниченных праймерами, в ходе ПЦР.

в

б

а

Рисунок 3. Динамика реакции ПЦР при разных изначальных концентрациях искомых молекул ДНК в пробе.
(а) – наибольшая концентрация
(б) – промежуточная концентрация
(в) – наименьшая концентрация

K+

K-

Рисунок 4. Агарозный электрофорез продуктов ПЦР.
К+ – положительный контроль (заведомо присутствует искомая ДНК).
1-7 – исследуемые образцы (из них 1-2 – положительные, 3-7 – отрицательные).
K- –отрицательный контроль (заведомо отсутствует искомая ДНК).
Во многих случаях помимо целевого продукта видны более легкие неспецифические продукты реакции (праймер-димеры).

Рисунок 5. Способы детекции при использовании ПЦР в реальном времени.
(а) – интеркалирующий краситель – флуоресцирует при связывании с двухцепочечной ДНК
(б) – зонд Taqman – флуоресценция возникает при расщеплении зонда ДНК полимеразой с 5’-3’ эндонуклеазной активностью за счет разделения флуорофора и гасителя.
(в) – зонд MolecularBeacon - флуоресценция возникает при гибридизации зонда с целевым фрагментом за счет пространственного отдаления флуорофора и гасителя
(г) – зонды LightCycler - флуоресценция акцептора возникает при гибридизации зондов (содержащих акцептор и донор) с целевым фрагментом за счет резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).

Дата добавления: 2015-07-25