Основные методы исследования генетики человека.

Клинико-генеалогический метод был введен в конце XIX века Ф. Гальтоном. Он основан на построении родословных и прослеживании в ряду поколений передачи определенного признака.

Этапы генеалогического анализа:

1) сбор данных о всех родственниках обследуемого (анамнез);

2) построение родословной;

3) анализ родословной и выводы.

Метод позволяет установить:

1) является ли данный признак наследственным;

2) тип и характер наследования;

3) зиготность лиц родословной;

4) пенетрантность гена,

5) вероятность рождения ребенка с данной наследственной патологией.

Составление родословной начинают со сбора сведений о семье консультирующегося или пробанда. Консультирующимся называется лицо, обратившееся к врачу, или первое попавшееся в поле зрения исследователя лицо. Пробанд - больной или носитель изучаемого признака. Во многих случаях консультирующийся и пробанд являются одним и тем же лицом. Дети одной родительской пары называются сибсами (братья и сестры). Семьёй в узком смысле называют родительскую пару и их детей, но иногда и более широкий круг кровных родственников, хотя в последнем случае лучше применять термин род. Сложность сбора анамнеза заключается в том, что пробанд должен хорошо знать, по-возможности, большинство своих родственников и состояние их здоровья.

Клинико-синдромологический метод позволяет выявлять морфологические, биохимические и функциональные признаки наследственных форм патологии (например, дефицит плазменного фактора VIII при подозрении на гемофилию А; кариотип 45,Х0 при подозрении на синдром Шерешевского – Тернера; поражения скелета, ССС и глаз при подозрении на синдром Марфана).

Близнецовый метод изучения генетики человека введен в медицинскую практику Ф. Гальтоном в 1876 г. Он позволяет определить роль генотипа и среды в проявлении признаков.

Различают моно- и дизиготных близнецов. Монозиготные (однояйцевые) близнецы развиваются из одной оплодотворенной яйцеклетки, имеют совершенно одинаковый генотип и, если они отличаются фенотипически, то это обусловлено воздействием факторов внешней среды. Дизиготные (двуяйцевые) близнецы развиваются после оплодотворения сперматозоидами нескольких одновременно созревших яйцеклеток, будут иметь раз­ный генотип, и их фенотипические различия обусловлены как генотипом, так и факторами внешней среды. Монозиготные близнецы имеют большую степень сходства по признакам, которые определяются в основном генотипом. Например, монозиготные близнецы всегда однополы, у них одинаковые группы крови по разным системам (ABO, Rh, MN и др.), одинаковый цвет глаз, однотипны дерматоглифические показатели на пальцах и ладонях и др. Эти фенотипические признаки и используются в качестве критериев диагностики зиготности близнецов.

Процент сходства группы близнецов по изучаемому признаку называется конкордантностью, а процент различия - дискордантностью. Так как монозиготные близнецы имеют одинаковый генотип, то конкордантность их выше, чем у дизиготных.

Для оценки роли наследственности и среды в развитии того или иного признака используют формулу Хольцингера:

КМБ% - КДБ%

Н = ————————

100% - КДБ%

где Н - доля наследственности, КМБ% - конкордан­тность монозиготных близнецов, КДБ% - конкордантность дизиготных близнецов.

Популяционно-статистический метод изучения генетики человека основан на использовании закона Харди-Вайнберга. Он позволяет определять частоту генов и генотипов в популяциях людей. Например, гомозиготы по гену HbS в Беларуси практически не встречаются, а в странах Западной Африки частота их варьирует от 25% в Камеруне до 40% в Танзании. Изучение распространения генов среди населения различных географических зон (геногеография) дает возможность установить центры происхождения различных этнических групп и их миграции, определить степень риска появления наследственных болезней у отдельных индивидуумов.

Цитогенетический метод основан на микроскопическом исследовании хромосом с целью выявления структурных нарушений в хромосомном наборе (кариотипирование). В качестве материала используют тканевые культуры с большим числом делящихся клеток, чаще лимфоциты периферической крови. Хромосомы на стадии метафазы изучают при помощи специальных методов окрашивания и составляют идиограммы (систематизированные кариотипы с расположением хромосом от наибольшей к наименьшей).

Этапы метода:

1) культивирование клеток человека (чаще лимфоцитов) на искусственных питательных средах;

2) стимуляция митозов фитогемагглютинином (ФГА);

3) добавление колхицина (разрушает нити веретена деления) для остановки митоза на стадии метафазы;

4) обработка клеток гипотоническим раствором, вследствие чего хромосомы рассыпаются и лежат свободно;

5) окрашивание хромосом;

6) изучение под микроскопом и фотографирование;

7) вырезание отдельных хромосом и построение идиограммы.

Метод позволяет выявлять геномные (например, болезнь Дауна) и хромосомные (например, синдром кошачьего крика) мутации. Хромосомные аберрации обозначают номером хромосомы, короткого или длинного плеча и избытком (+) или нехваткой (-) генетического материала. Например, синдром кошачьего крика обозначают: 5р-.

Биохимические методы основаны на изучении активности ферментных систем (либо по активности самого фермента, либо по количеству конечных продуктов реакции, катализируемой данным ферментом). Они позволяют выявлять генные мутации - причины болезней обмена веществ (например, фенилкетонурия, серповидно-клеточная анемия). С помощью биохимических нагрузочных тестов можно выявлять гетерозиготных носителей патологических генов, например, фенилкетонурии. Исследуемому человеку вводят внутривенно определенное количество аминокислоты фенилаланина и через равные промежутки времени определяют его концентрацию в крови. Если человек гомозиготен по доминантному гену (АА), то концентрация фенилаланина в крови довольно быстро возвращается к контрольному уровню (определяется до введения фенилаланина), а если он гетерозиготен (Аа), то снижение концентрации фенилаланина идет вдвое медленнее. Аналогично проводятся тесты, выявляющие предрасположенность к сахарному диабету, гипертонии и др. болезням.

Объекты исследования:

· метаболиты в биологических жидкостях и клетках (например, фенилаланин при фенилпировиноградной олигофрении; кетоновые тела (КТ) при сахарном диабете);

· аномальные белки (например, НЬ при гемоглобинопатиях);

· дефектные ферменты (например, холинэстераза, глутатионпероксидаза, каталаза).

Этапы исследования:

· первый - использование скрининговых программ диагностики (например, тонкослойной хроматографии, электрофореза, микробиологических методов);

· второй - применение подтверждающих методов (например, флюорометрических, спектрофотометрических, количественного определения метаболитов, тестирования активности фермента).

Молекулярная диагностика. Эти методы позволяют анализировать фрагменты ДНК, находить и изолировать отдельные гены и сегменты генов и устанавливать в них последовательность нуклеотидов. Для широкого применения в практическом здравоохранении методов рекомбинантной ДНК необходимо создание библиотек радиоактивных зондов всех последовательностей ДНК генома человека, что теперь успешно выполняют.

1. Метод клонирования ДНК позволяет изолировать отдельные гены или их части, транскрибировать (создавать их копии) и транслировать изолированные гены. Это стало возможным благодаря открытию ферментов-рестриктаз.

2. Гибридизация нуклеиновых кислот. При этом методе линейные отрезки двухцепочечной ДНК подвергают тепловой обработке и получают одноцепочечные фрагменты (денатурирование). Денатурированную ДНК инкубируют при таких условиях (t = 37°С), когда происходит гибридизация, т.е. взаимное распознавание двух комплементарных нитей посредством спаривания азотистых оснований. Часто для идентификации порядка нуклеотидов используют в качестве «зонда» одну радиоактивную нить ДНК. Можно идентифицировать как полностью, так и частично гомологичные последовательности. Специфич­ность гибридизации нуклеиновых кислот позволяет обнаружить единственный ген среди десятков тысяч. Различные модификации этого метода позволяют в клинике анализировать очень малые количества ДНК, взятые у больного.

Блот-гибридизация. Для выявления интересующих (в том числе мутантных) генов ДНК подвергают рестрикции. Полученные фрагменты ДНК подразделяют по молекулярной массе, денатурируют и переносят на носитель (нейлоновую или иную мембрану). Фиксированную на носителе в виде пятна ДНК гибридизируют с меченным радиоактивным изотопом ДНК- или РНК-зондом. В результате определяют положение аномального фрагмента ДНК.

3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) применяется для изучения регионов предполагаемых мутаций и других особенностей структуры ДНК. Для исследования можно использовать любой биологический материал, содержащий ДНК (например, кусочек ткани, каплю или пятно крови, смыв полости рта, луковицу корня волос). На первом этапе исследуемую ДНК подвергают отжигу: расщепляют на две нити при нагревании до 95-98 °С. Затем одну из нитей гибридизируют и стимулируют синтез последовательности, комплементарной исследуемой ДНК (с помощью термофильной ДНК-полимеразы). В первом цикле ПЦР гибридизацию выполняют с исследуемым фрагментом ДНК, а в последующих - с вновь синтезированными. При каждом цикле реакции число синтезированных копий участка ДНК увеличивается двукратно. Циклы повторяют до накопления нужного количества ДНК. Эту методику разработал и предложил Кэри Муллис.

Методы генетики соматических клеток дают возможность изучать многие вопросы генетики человека в эксперименте. Для культивирования чаще используют клетки соединительной ткани (фибробласты) и лимфоциты крови. На искусственных питательных средах их можно клонировать, т.е. получать потомков одной клетки. Все они будут иметь одинаковый генотип (как монозиготные близнецы) и, следовательно, на клеточном уровне можно изучать роль генотипа и среды в проявлении признаков.

Можно проводить селекцию клеток - отбор клеток с заранее заданными свойствами. Для этого используют селективные питательные среды. Например, если в питательную среду добавить не лактозу, а другие сахара, то из большого числа клеток найдется несколько, которые смогут существовать без лактозы, и в дальнейшем можно получить клон таких клеток.

Наибольший интерес для генетики человека представляет метод гибридизации соматических клеток. В 1960 г. французский ученый Ж. Барский, выращивая в культуре клетки две линии мышей, обнаружил, что некоторые из них по своим морфологическим и биохимическим свойствам оказались промежуточными между исходными родительскими клетками. Это были гибридные клетки. Такое спонтанное слияние соматических клеток в куль­туре ткани происходит довольно редко. В дальнейшем было установлено, что при введении в культуру клеток РНК-содержащего вируса парагриппа Сендай, инактивированного при облучении ультрафиолетом, частота гибридизации клеток значительно повышается, и в смешанной культуре разных типов клеток образуются гетерокарионы -клетки, содержащие два ядра разных клеток в одной цитоплазме. Часть таких клеток способна размножаться митозом. После митоза из двухядерного гетерокариона образуются две одноядерные клетки, каждая из которых представляет собой синкарион - настоящую гибридную клетку, содержащую хромосомы обеих исходных клеток.

Гибридизация возможна не только между клетками организмов разных видов, но и типов: человек-мышь, человек-комар и др. Синкарионы обычно удается получать при гибридизации клеток разных видов, относящихся к одному классу. В таких синкарионах происходит объединение геномов двух видов. Например, гибридные клетки человека и мыши имеют 43 пары хромосом: 23 - от человека и 20 - от мыши. В дальнейшем происходит постепенное удаление хромосом того организма, клетки которого имеют более медленный темп размножения. У гибридных клеток человек-мышь удаляются хромосомы человека. В гибридных клетках функционируют хромосомы как человека, так и мыши, гены которых детерминируют синтез соответствующих белков. Морфологически можно отличить каждую из хромосом (дифференциальное окрашивание). Если в гибридной клетке отсутствует какая-либо хромосома и не происходит синтез каких-то белков, то можно предположить, что гены, детерминирующие синтез этих белков, локализованы в данной хромосоме. Таким образом, метод позволяет устанавливать группы сцепления у человека, а используя нехватки и транслокации - выяснять и последовательность расположения генов, т.е. строить генетические карты хромосом человека.

Биологическое моделирование определенных наследственных аномалий человека можно проводить на мутантных линиях животных, имеющих сходные нарушения. Например, у собак встречается гемофилия, обусловленная рецессивным сцепленным с Х-хромосомой (с полом) геном; несращение губы и неба у мышей сходно с аналогичными аномалиями человека; у хомяков и крыс встречаются сахарный диабет, ахондроплазия, мышеч­ная дистрофия и др. Хотя мутантные линии животных не дают точную картину наследственных болезней человека, даже частичное воспроизведение их фрагментов в ряде случаев позволяет изучить механизмы первичного отклонения от нормы. Закон гомологичных рядов Н. И. Вавилова (виды и роды генетически близкие обладают сходными рядами наследственной изменчивости) позволяет с определенными ограничениями экстраполировать экспериментальные данные на человека.

Математическое моделирование - это метод создания и изучения математических моделей. Его применяют для расчетов частот генов в популяциях при различных воздействиях и изменениях окружающей среды. Математические методы широко применяются в тех случаях, когда невозможно использование экспериментальных методов (например, анализ большого количества сцепленных генов у человека).

Медицинская генетикаизучает роль наследственности и изменчивости в возникновении, развитии и исходах патологии человека, разрабатывает методы диагностики, лечения и профилактики наследственных и ненаследственных заболеваний.

Медицинская генетика как наука базируется на ряде принципиальных положений, раскрывающих суть проблемы наследственных болезней человека и принятых в настоящее время как аксиомы:

• наследственные болезни являются частью общей наследственной изменчивости человека. Нет резкой границы между наследственной изменчивостью, ведущей к изменению нормальных признаков, и изменчивостью, приводящей к возникновению наследственных болезней;

• в развитии наследственных признаков или болезней принимают участие наследственная конституция и внешняя среда. При этом для развития одних признаков или болезней определяющую роль играет наследственность, а для других существенное значение имеет внешняя среда, но нет таких признаков, которые зависели бы только от наследственности или только от среды;

• наследственная отягощенность современного человечества состоит из накопленных в процессе эволюции патологических мутаций и из вновь возникающих наследственных изменений в половых клетках. Количественный объем вновь возникающих мутаций может увеличиться под влиянием мутагенных факторов среды:

• ионизирующая радиация;

• химические вещества;

• другие воздействия;

• среда обитания человека продолжает изменяться, что приводит к появлению новых видов наследственной патологии - экогенетических болезней, поскольку меняется генетическая структура популяций человека:

• расширился круг потенциальных брачных партнеров;

• широких масштабов достигла миграция населения;

• увеличивается мутагенная нагрузка;

• современная медицина обладает большими возможностями в диагностике, лечении и профилактике наследственных болезней, а в будущем будет обладать еще большими. Больной или носитель патологического задатка - полноправный член общества и имеет равные права со здоровым человеком. Прогресс медицины и общества приводит к следующему:

• увеличение продолжительности жизни больных с наследственными болезнями;

• восстановление у них репродуктивной функции;

• и, следовательно, рост их числа в популяции.

Медицинская генетика помогает понять взаимодействие биологических и средовых факторов в патологии человека. На основании медико-генетических знаний приобретаются навыки диагностики наследственных болезней.

В настоящее время сложилась стройная система профилактики наследственных болезней, куда входят:

• медико-генетическое консультирование;

• перинатальная диагностика;

• массовая диагностика у новорожденных наследственных заболеваний обмена, поддающихся диетической и лекарственной терапии;

• диспансеризация больных и членов их семей.

Внедрение этой системы обеспечило снижение частоты рождения детей с врожденными пороками развития и наследственными болезнями на 60-70%.

Исходя из уже реализуемых в практическом здравоохранении достижений генетики, можно прогнозировать такие перспективы:

• широкое применение преимплантационной диагностики в основных медико-генетических центрах;

• проведение генетического тестирования на болезни с наследственным предрасположением и принятие, согласно полученным результатам, профилактических мер;

• создание новых подходов и методов лечения (в том числе генная терапия отдельных заболеваний);

• производство новых типов лекарств на основе генной информации;

• население среднего и старшего возраста может быть обследовано на предмет риска многих болезней, которые могут быть предупреждены или облегчены путем диетического или лекарственного воздействия;

• проверка индивидуальной чувствительности к лекарствам молекулярно-генетическим методом должна стать стандартной процедурой перед любым медикаментозным лечением.

МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ КОНСУЛЬТИРОВАНИЕ

Отрасль профилактической медицины, главной целью которой является предупреждение рождения детей с наследственной патологией. Появление генетической консультации как самостоятельного учреждения обычно связывают с именем S.С. Reed (1947), однако еще в 30-х годах русский клиницист-генетик С.Н. Давиденков проводил генетическое консультирование и сформулировал основные положения по методике консультирования семей с наследственными заболеваниями нервной системы (1934). Современная генетическая консультация призвана служить интересам семьи и общества.

Цель генетической консультации - установление степени генетического риска в обследуемой семье и разъяснение супругам в доступной форме медико-генетического заключения.

Задачи медико-генетического консультирования:

1) про- и ретроспективное (до и после рождения) консультирование семей и больных с наследственной или врожденной патологией;

2) пренатальная диагностика врожденных и наследственных заболеваний;

3) помощь врачам различных специальностей в постановке диагноза заболевания, если для этого требуются специальные генетические методы исследования;

4) объяснение в доступной форме пациенту и его семье степени риска иметь больных детей и помощь им в принятии решения;

5) ведение территориального регистра семей и больных с наследственной и врожденной патологией и их диспансерное наблюдение;

6) пропаганда медико-генетических знаний среди населения.

Коротко говоря, задачей генетической консультации является составление генетического прогноза в семье индивидуума с аномалией физического, психического либо полового развития и выбор профилактических мероприятий по предупреждению рождения больного ребенка.

Составление генетического прогноза.

1. Определение степени генетического риска. Под генетическим риском понимают вероятность проявления определенной аномалии у самого пациента (пробанда) или его родственников, которая выражается в процентах (от 0 до 100%). Общий риск появления генетически обусловленной аномалии для популяций европейцев составляет 3-5% (генетический груз), поэтому риск, который не превышает 5%, расценивается как низкий. Генетический риск до 10% называют повышенным в легкой степени, до 20% - повышенным в средней степени и свыше 20% - высоким. С генетической точки зрения можно пренебречь риском, не выходящим за пределы повышенного в легкой степени, и не считать его противопоказанием к дальнейшему деторождению, даже тогда, когда нет возможности пренатальной диагностики предполагаемой аномалии. Генетический риск средней степени расценивается как противопоказание к деторождению, т.е. как показание к прерыванию беременности, если семья не хочет подвергаться риску.

2. Оценка тяжести медицинских и социальных последствий предполагаемой аномалии. Степень генетического риска далеко не всегда соответствует степени тяжести ожидаемого страдания. Например, полидактилия (аутосомно-доминантный тип наследования, с высокой степенью генетического риска - не менее 50%) может быть легко устранена соответствующей корригирующей операцией, и человек может вести нормальный образ жизни, в то время как фенилкетонурия, риск повторения которой у детей гетерозиготных родителей составляет 25%, представляет собой тяжелое заболевание, плохо поддающееся лечению. Степень страдания во втором случае с точки зрения медицины и социальных последствий для больного и его семьи расценивается как тяжелая.

Перспектива применения и эффективность методов пренатальной диагностики. Достижения в этой области позволяют планировать деторождение в семьях с высоким риском наследования тяжелой патологии (болезни Дауна, мукополисахаридоза, гемофилии, муковисцидоза и др.), так как эти заболевания можно достоверно выявить методами пренатальной диагностики.

Показания для направления семьи в медико-генетическую консультацию:

1) наличие сходных заболеваний у нескольких членов семьи;

2) первичное бесплодие супругов;

3) первичное невынашивание беременности;

4) отставание ребенка в умственном и физическом развитии;

5) рождение ребенка с пороками развития;

6) первичная аменорея, особенно с недоразвитием вторичных половых признаков;

7) наличие кровного родства между супругами.

Основные показания для проведения цитогенетического анализа:

1) пренатальная диагностика пола в семьях, отягощенных рецессивными заболеваниями, сцепленными с полом; гетерозиготность матери по Х-сцепленному рецессивному заболеванию;

2) гетерозиготность обоих родителей по одной паре аллелей при аутосомно-рецессивном наследовании;

3) недифференцированная олигофрения (слабоумие);

4) привычные выкидыши и мертворождения неясного генеза в анамнезе;

5) множественные врожденные пороки развития у ребенка;

6) бесплодие у мужчины;

7) пренатальная диагностика при возрасте матери свыше 35 лет, отца - 40 лет.

Основные показания для проведения биохимических анализов или методов рекомбинантной ДНК:

1) умственная отсталость ребенка;

2) нарушение психического статуса;

3) нарушение физического развития;

4) судороги, мышечная гипо- или гипертония, нарушение походки и координации движений, желтуха, гипо- или гиперпигментация;

5) непереносимость отдельных пищевых продуктов и лекарственных препаратов, нарушения пищеварения.

Точность прогноза зависит от следующих факторов:

1) точности клинико-генетического диагноза,

2) тщательности и объективности генеалогического исследования,

3) знания новейших данных генетики.

Точно поставить клинико-генетический диагноз в настоящее время сложно в связи с тем, что в 75% случаев обследованных семей наблюдается единичное проявление аномалии. Благодаря популяризации медицинских знаний среди населения и качества подготовки врачей общего профиля, родители обращаются в медико-генетическую консультацию уже при рождении первого ребенка с аномалиями. Правильный диагноз обеспечивается применением вышеперечисленных методов генетики человека.

Генеалогический анализ до сих пор является основным методом в практике генетических консультаций. Необходимо, чтобы генетический анамнез был полным и подтверждался медицинской документацией в отношении пробанда и всех его родственников, что сделать весьма трудно.

Знакомство с новейшими данными медицинской генетики необходимо как для диагностики (ежегодно описываются сотни новых наследственных аномалий), так и для выбора наиболее современных и рациональных направлений профилактики и методов пренатальной диагностики.

При медико-генетическом консультировании возникают некоторые трудности морально-этического характера.

1. Вмешательство в семейную тайну. Эта проблема возникает при сборе данных для построения родословных, при выявлении носителей патологического гена, при несовпадении паспортного и биологического отцовства и др. Проблема разрешается корректным отношением врача к пациенту.

2. Необходимость стерилизации или искусственного оплодотворения при высокой степени генетического риска. Эта проблема должна решаться законодательным путем.

3. Ответственность врача-генетика за дачу совета на основании вероятностного прогноза. Необходимо, чтобы пациент понял медико-генетическую информацию. Консультант не должен давать категорические советы, метод его работы - убеждение. Окончательное решение принимают сами консультирующиеся.

Дата добавления: 2015-07-16