Торможение Гемагглютинации (HIA)

Исторически сила белково-углеводного взаимодействия полуколичественно измерялась Ландстайнеровским методом торможения гаптена, часто называемым методом торможения гемагглютинации, или HIA (Рисунок 13). Этот метод известен и практикуется в течение нескольких десятилетий и широко применяется для оценки вирусных и вирусно антигенных измерений титрования. Этот тест основан на наблюдении, что целые вирусные частицы агглютинируют, или агрегируют, красные кровяные клетки, производя студенистую фазу по всей толщине тестового раствора. Для исследования подходят клетки разнообразных млекопитающих и птиц, но чаще всего используют свиные и куриные эритроциты. Эритроциты антикоагулируются с, к примеру, цитратом и разжижаются. Добавление растворимого лектина, обычно с концентрацией от 0,1 до 0,01 мг/мл, даёт поперечно-связанную матрицу. Добавление растворимого лектина в присутствии растворимого лиганда приводит у меньшенному уровню осадка. Наконец, реакция преципитации полностью предотвращена, и метод предлагает минимальную концентрацию углевода, который тормозит реакцию гемагглютинации. Тест часто распространяют на использование агрегации и осаждения других мультивалентных лигандов, включая гликоген, дрожжевую камедь и гранулы крахмала. Поскольку в тесте обычно используется серийное разбавление, ошибка достигает до плюс-минус одной пробы, или фактора двух (?). Несмотря на то, что порядок игибиторной способности в общем не зависит от различий в источнике и возрасте эритроцитов, данные по половине игибирующей концентрации (ИК50) сильно варьируются.

Стало общепринятым считать значения ИК50 из изучений агглютинации заменителем констант диссоциации; такие параллели необоснованны. Помимо проблемы получения активностей, такие сравнения требуют условия обратимости, которой может и не быть, и эквивалентных концентраций сравниваемых лигандов. Отклонения от последнего условия широко варьируются от условия к условию. Вкратце, методы торможения гемагглютинации – это быстрый простой способ, который направляет растворимые лиганды с примерным порядком сродства связывания. Получение более подробной информации из этого метода проблематично.

4.Связывание мультивалентных сахаридных лигандов: кластерный гликозидный эффект

За последние 10 лет появилось неисчислимое количество исследований связывания мультивалентных сахаридов с лектинами. Здесь мы сфокусируемся на тех из них, что обеспечивают достаточное упрощение чистого измерения стимуляции на валентно-скорректированном основании; Таблица 1 внизу объединяет несколько таких исследований. Мы не пытались исчерпывающе свести в таблицу данные по связям. Для чёткости мы отметили только самую значительную стимуляцию, самые принципиальные улучшения. Мы также включили ряд соединений, которые проанализировали и нашли величину стимуляции.

Таблица отображает несколько направлений, стоящих объяснения:

● В большинстве своём все мультивалентные лиганды, независимо от валентности лиганда, валентности лектина, конструкции лиганда или способа связывания показывают некое улучшение в активности по сравнению с моновалентными лигандами на валентноскорректированном основании.

● Величина кластерного гликозидного эффекта невероятно сильно варьируется, и улучшение связывания на 1 моль сахаридного основания изменяется от 0 до 10⁶. Несмотря на то, что существование достаточной изменчивости делает появление недвусмысленных заключений невозможным, появилась тенденция, которая связывает увеличение улучшений связывания с возрастанием валентности. Так, улучшения наблюдаемые для линейных полимеров величиной примерно 10⁵, для дедримеров больше почти в 10³ раз, для гликокластеров – в 10². Вне этой обширной категоризации отношения между валентностью и сродством (аффиностью) неясны. Среди низко-валентных лигандов, с валентностью хотя бы до 20, нет различимой взаимосвязи между валентностью и аффиностью; было сообщено об улучшениях для бивалентных лигандов величиной до 1000 и для девятивалентных уже не более 0,4.

● Есть возможность существования взаимосвязи между величиной кластерного гликозидного эффекта и методом измерения. Средняя величина улучшения, измеряемая при помощи ITC, – 86, Spr, – 150, ELLA, – 45 000 и с помощью HIA (раздел 3.1), – 150 000. Однако, существуют огромные отклонения от этих средних величин, и данного набора данных недостаточно для получения точных выводов. Тем не менее, при условии, что способы измерения работают в чрезвычайно различающихся концентрационных режимах и измеряют различные физические свойства, стоит заметить, что величина изучаемого кластерного гликозидного эффекта может быть связана с процессом измерения.

● Не существует очевидной связи между валентностью лектина и величиной кластерного гликозидного эффекта. Чтобы убедиться в этом, самые большие улучшения наблюдаются для полимерных лигандов, в отличие от вирусных частиц. Эффект как валентности лиганда, так и HIA способа, предположительно способствует этой тенденции, а степень дальнейшего влияния валентности лектина на эти улучшения не ясна.

● В образцах, где связывание оценивалось более, чем одним методом, наблюдалось значительное несоответствие между полученными значениями. Тун и коллеги оценивали связывание серий маннозид-ладеновых дендримеров посредством ITC, ELLA и HIA (Таблица 2). Эти отклонения едва ли кого-то удивят, поскольку каждая техника измеряет явление, которое включает результат связывания, как мы обычно себе это представляем, но отчёт делается не только лишь о явлении связывания. Эти наблюдения дают другое предостерегающее замечание к интерпретации данных по связыванию.

Дата добавления: 2015-07-16