Молекулярная интерпретация кластерного гликозидного эффекта

5.1 Внутримолекулярное связывание: хелатный эффект

Мнение о том, что бивалентный лиганд связывается с бивалентным рецептором с большей аффиностью, по сравнению с моновалентным аналогом, общепринято в химии, особенно в органической, где известно множество природных и синтетических хелатов. Любой термодинамический параметр, характеризующий бивалентную ассоциацию молекул, связан с соответствующим элементом для моновалентной ассоциации посредством энергии взаимосвязи:

ΔJ_bi = 2ΔJ_mono + ΔJ_int,

Где ΔJ представляет изменение в любом термодинамическом свойстве во время связывания, «би» относится к тому же параметру для бивалентного лиганда, «моно» относится к тому параметру для моновалентного лиганда и «int» относится к параметру взаимосвязи, или энергетическому влиянию физической связи. Мы полностью заинтересованы в определении свободных энергий взаимодействия. Из-за того, что иногда более доступно рассмотрение энтальпийных и энтропийных вкладов в энергию взаимосвязи, мы приведём это распределение здесь

5.1.1 Энтропийные вклады в свободные энергии взаимосвязи

Энергии взаимосвязи для мультивалентного комплексирования традиционно рассматриваются в энтальпийных выражениях. Полная энтропия частицы может быть представлена в виде алгебраической суммы четырёх компонентов, а именно: трансляционной, ротационной, конформационной энтропий и энтропии ассоциации в растворе. Похожим образом, энтропия взаимосвязи может быть рассмотрена, как сумма похожих наборов значений.

Трансляционная и ротационная энтропии. До связывания с лигандом, как лиганд, так и рецептор сободны для перемещения в трёх измерениях и вращения по трём основным осям. После связывания единичная частица агрегата сохраняет эти двигательные свободы. Обычно трансляционную и ротационную энтропию рассматривают как одно значение.

Трансляционная энтропия частица в газовой фазе описывается уравнением Сакур-Тетрода:

где k_B – константа Больцмана, T – температура, h – константа Планка, m₁ – масса молекулы мономера и N₁ – число мономером в частице агрегата.

Важно, что трансляционные энтропии изменяются пропорционально натуральному логарифму молекулярного веса. Похожим образом, ротационная энтропия частицы выражается, как:

Здесь выражают ротационные углы свободы по трём основным осям, а число симметрии молекулы.

Симметричная молекула ( >1) будет обладать ротационной энтропией, уменьшенной на количество, равное R log(). Опять ротационная энтропия имеет логарифмическую связь с ротационными углами свободы, которые, в свою очередь, к молекулярным измерениям, и косвенно с молекулярным весом лиганда.

Логарифмическая связь между молекулярным весом и трансляционной и ротационной энтропиями даёт то, что при связывании двух (или более) лигандов получается мультивалентный лиган и трансляционной и ротационной энтропиями, приблизительно равными таким же значениям у моновалентных лигандов. Связывание бивалентных лигандов, таким образом, происходит с благоприятным вкладом в сбободную энергию взаимосвязи для трансляционной и ротационной энтропий моновалентного лиганда. Полезность этого выражения определяющая, поскольку оно относится к большой доле свободной энергии взаимодействия. Хотя измерение трансляционной и ротационной энтропии в газовой фазе - относительно прямой процесс, ситуация в конденсированной фазе значительно усложняется. Способность молекулы двигаться в трёх измерениях значительно уменьшена в растворе, связанном с газовой фазой; сильно взаимодействующая жидкость, как, например, вода, будет ожидаемо проявлять сильный локализующий эффект. Трансляционная энтропия в газовой фазе органических молекул типичных размеров обычно достигает 15 ккал/моль при комнатной температуре. Оценки соответствующего значения в водном растворе очень сильно варьируются, изменяясь от 2,1 до >15 ккал/моль. Часто цитируемое Дженксом значение – 10,5 ккал/моль является в лучшем случае грубой оценкой, но оно никогда и не предполагалось, как строгое и быстрое значение. Большинство оценок находится у нижней границы диапазона значений и предполагаемы вклад значения суммы трансляционной и ротационной энтропий в свободную энергию взаимодействия, вероятно, не превышает 6 ккал/моль.

Конформационная энтропия. Ограничение конформационных степеней свободы во время связывания лиганда снижает общую энтропию молекулы. Несмотря на то, что выражение мысленно доступно, хотя бы со взгляда статистики, его измерение так же наполнено неопределённостью. Энтропия, относящаяся к вращательной моде связана с функцией внутренней перегородки:

где Ir – сниженный момент инерции относительно вращательных осей, и n – это число симметрии для внутреннего вращения.

Энтропия, связанная с этой функцией перегородки выражается, как:

Дженкс представил значение около 4,3 энтропийных единиц для ротационной энтропии полностью неограниченного ротора, обеспечивая максимальную потерю энтропии для локализации 1,4 ккал/моль при комнатной температуре; другие оценки пока что выше. Совсем недавно Маммен, Шахнович и Вайтсайдс предложили новейшую модель для измерения конформационной энтропии, и эта модель даёт значение вдвое менее грубое, чем то, что предложил Жженкс. Эта модель подверглась критике из-за её неполноты. Другие вычислительные и экспериментальные модели попадают между этими пределами.

Был предложен экспериментальный подход к измерению конформационной энтропии в белках. Этот метод начинается с параметров упорядочивания, полученных, в свою очередь, из экспериментов с магнитным резонансом. Вкратце, механизмы релаксации как диполярной, так и анизотропии химического сдвига связаны с молекулярным движением; измерении релаксации в различных областях может быть связано со спектральной плотностью или плотностью этих движений. Спектральная плотность может быть переведена в параметр порядка S, в свою очередь связанный с конформационной энтропией:

Тогда как эта работа главным образом была сфокусирована на энтропиях каркасов с рассмотрением амидного NH вектора, одна работа был сконцентрирована на измерении изменений в энтропии боковой цепи с использованием ¹³С и ²Н релаксационных параметров. Работа не была распространена на изучение малых молекул.

Продолжают накапливаться доказательства того, что потери конформационной энтропии во время лигандного связывания меньше, чем считалось ранее; даже метод Вайтсайдса может существенно переоценить значение. Ряд неприродных β- и γ-аминокислот, как было сообщено, образуют стабильные спиральные структуры, несмотря на то, что повышение конформационной энтропии далеко не способствует этому. Связь тетраацетата пропилендиамина с двухвалентным кальцием где-то на 5 ккал/моль менее предпочтительна, чем соответственная связь с тетраацетатом этилендиамина: потеря в свободной энергии на самом деле вся в энтальпии (Кристенсен и Тун, результаты не опубликованы). Сходным образом, Бандл и Бунс независимо синтезировали разнообразные конформационно «закрытые» олигосахариды, разработанные для того, чтобы избежать потерь в конформационной энтропии во время связывания (Рисунок 17). В этом событии все такие лиганды связываются с аффиностью, не превышающую ту, что была у исходного гибкого лиганда. Несмотря на вероятность закрытия лиганда в неблагоприятной ориентации при этих манипуляциях, что приведёт к энтальпийному снижению свободных энергий, калориметрическое изучение Бандла и коллег не выявило такого эффекта: для того количества, на которое свободные энергии связывания были уменьшены относительно несвязанных лигандов, потери были энтропийными по своей природе. Наконец, ЯМР исследования общей конформационной гибкости белка во время связи с лигандом, показали ряд изменений. В то время как многие протеины показали ожидаемое снижение гибкости, некоторые продемонстрировали повышенную гибкость после присоединения лиганда. В нескольки других примерах повышение конформационной гибкости в местах, отдалённых от места связывания, очевидно, возмещают убытки гибкости в месте связи.

Такие, по крайней мере, в некоторых случаях значительно меньшие, чем ожидалось, потери конформационной энтропии являются чем-то удивительным. Два правдоподобных объяснения раскрывают это наблюдение. Во-первых, связанные лиганды могут сохранять значительную гибкость. Во-вторых, свободный лиганд может иметь доступ к значимо меньшим конформационным состояниям по сравнению с абсолютно несвязанным лигандом. Такая преорганизация может возникнуть из предпочтительных взаимодействий между порциями очень отдалёнными в последовательности, или из-за сольвофобных эффектов, которые схлопывают лиганд для уменьшения доступной поверхности. Мы со своей стороны отметим, что лиганду не надо быть преорганизованным в благоприятную конформацию для связывания, чтобы минимизировать потери в конформационных степенях свободы.

Вклады в ∆Si, связанные с растворением. Возможно, наибольший вклад в неопределённость в мультивалентном связывании идёт от энтропии, связанной с растворением. Молекулярные основы изменений в энтропии, связанной с растворением различных веществ остаётся слабо понятной. Лучшей экспериментальной мерой термодинамического влияния реорганизации сольвента во время процессов в водном растворе остаётся изменение в молярной теплоёмкости, которое сопровождает процесс. С другой стороны, взаимосвязь между ∆Cp и энтальпией, связанной с растворением (и, в общем, энтропией) слабая, и значительные различия могут быть незаметными для этой меры. Хотя наблюдение за значительным различием в ∆Cp во время связывания родственных лигандов вероятно обозначает значительный вклад термодинамики растворения в общий процесс связывания.

5.1.2 Энтальпийные вклады в свободные энергии взаимодействия

Хотя энергии взаимодействий обычно рассматриваются с энтропийной позиции, энтальпийные эффекты так же играют важную роль в определении общей аффиности мультивалентного лиганда. Два эффекта могли, в принципе, делать вклад в это значение. В первом связующее звено могло изменять положение лиганда внутри места связи; этот эффект мог бы неблагоприятно сказываться на энтальпии взаимодействия. Во втором линкер мог сам по себе обеспечить вклад, либо взаимодействую с поверхностью белка на периферии места связи или на расстоянии между местами, либо через неблагоприятные пространственные взаимодействия, которые развиваются из-за ограничений, связанных со связующим звеном. Неудобный вклад от предыдущего члена относительно легко преодолеть; нужно обеспечить линкерам достаточную длину и гибкость для облегчения оптимального позиционирования домена углеводного распознавания в месте связи. В большинстве своём, в образцах, представленных в таблице 1, связующее звено не обладает достаточной длиной, чтобы охватить два места связи в единичном белке. В таких случаях практически безграничный неблагоприятный вклад в ∆Н1 исключает внутримолекулярное связывание.

В случаях, где связующие звенья не исключают возможность внутримолекулярного бивалентного связывания, энтропия взаимодействия содержит составляющие, появляющиеся из-за контактов между связующим звеном и поверхностью белка, и неблагоприятных пространственных взаимодействий, которые появляются в линкере во время связывания. Ожидается, что этот эффект будет значительным. Несколько групп успешно заменили участки домена углеводного связывания пептидом или аналогами протеина; несомненно, что другие молекулярные последовательности, нежели углеводные, могут взаимодействовать выгодным образом с местом связывания лектина. Хотя предпочтительные энтальпии, возникающие из-за контактов между линкером и поверхностью белка, могут в принципе насчитывать нескольких ккал/моль, в общем случае эффект неопределим и его сложно предсказать. Также есть вызывающие интерес предположения о том, что ограничение связующих звеньев во время межмолекулярного хелатного связывания может привести к значительным и невыгодным изменениям в энтальпии, поскольку связи линкера будут заперты в гош-, или в заслонённые ориентации. В ретроспективе таки эффекты кажутся неизбежными и, вероятно, оказывают большое влияние на общие энергии взаимодействия. Метил-метил гош-взаимодействие даёт в грубом приближении 1 ккал/моль невыгодной энтальпии; двойной гош-пентан обеднён на 4 ккал/моль по отношению ко всей анти-форме. Заслонённые конформеры даже более проблематичны; барьер для вращения вокруг связи углерод-углерод этана – 3 ккал/моль, когда у заслонённого бутана по связи С2-С3 – 5-6 ккал/моль свыше зигзагообразной анти-формы. Зная величину таких эффектов, вряд ли можно удивиться тому, что даже малые отклонения от конформаций минимальной энергии в связанной форме обеспечит существенный невыгодный энтальпийный вклад в свободные энергии взаимодействия. Уменьшение свободной энергии связывания тетраацетата пропилендиамина с Са(II), связанным с EDTA, на самом деле полностью связано с потерей в энтальпии; в соответствии с кристаллографическими исследованиями металлического хелата, оказывается вероятным то, что создание заслонённого взаимодействия в пропиленовом каркасе ответственно за большую часть от этой потери (Кристенсен и Тун, неопубликованные результаты). Пенел и Дойг недавно предположили, что подобные энергии деформации возбуждаются, когда боковые цепи аминокислот далеко удалены от конформеров низкой энергии и делают существенный вклад в общую свободную энергию, противодействуя спирализации в коротких пептидах. Это исследование навело на мысль, что этот эффект был как минимум равен потере в конфигурационной энтропии, а возможно и значительно больше.

5.1.3. Важность внутримолекулярного связывания в углеводно-белковом взаимодействии

Чтобы застрять во внутримолекулярной модели, свободная энергия связывания для бивалентного комплексообразования лишь должна быть больше, по сравнению с моновалентным связыванием; другими словами, энергия взаимодействия не может быть более невыгодной, чем абсолютное значение свободной энергии связывания слабейшего из двух эпитопов распознавания. Фактически это условие строго для белково-углеводного взаимодействия, где энергии моновалентного взаимодействия малы, а расстояния между местами связывания велики. Для большинства лигандов, представленных в таблице 1, связующее звено слишком коротко, чтобы охватить два места связывания на единичном белке, и связывание хелатного типа исключено априори. В некоторых примерах, однако, межмолекулярное связывание вероятно. Большинство примеров из этой модели включают либо бактериальные двухкомпонентные токсины, либо полимерные лиганды.

Бактериальные двухкомпонентные токсины, особенно термолабильный токсин E. coli, Шига и похожие на него токсины (SLT), холерный токсин, предлагают особые возможности для конструирования высоко-аффиных лигандов, которые действуют через хелатный эффект. В отличие от большинства лектинов, бактериальные токсины направляют все пять мест связывания вдоль одной оси, все результате они не агрегируют с эритроцитами и, возможно, менее восприимчивы к кучности с мультивалентными лигандами, чем растительные лектины. SLT токсины ещё и обладают необычно малыми размерами, с молекулярным весом субъединиц в районе 7700 Дальтонов. Подобласть связывания очевидно содержит три места связывания в каждом мономере, способном к взаимодействию с трисахаридным рецептором, а расстояния между этими местами не превышают 10 Å. Фэн, Хол и коллеги разработали пятивалентный лиганд для термолабильный токсин E. coli (Рисунок 11). Активности этих лигандов были измерены протоколом твердофазного иммуноферментного анализа; лучшие лиганды показали улучшение в 10⁴ раз по сравнению с моновалентным лигандом на валентно-скорректированном базисе. Авторы исключили совокупный механизм улучшений через использование исследований динамического рассеяния света, хотя растворы были пропущены через достаточно малые фильтры для удаления крупных примесей до измерений. Дистанции между местами связывания на этом белке примерно 45 Å, что делает конструирование лигандов хелатного типа перспективным. Авторы использовали концепцию эффективной длины, недавно представленной Крамером и Карпеном. В ней энтропийные убытки, появляющиеся из-за ограничения конформационных степеней свободы, сами ограничены благодаря использованию линкеров значительно более длинных, чем требуется для дистанций между местами связывания. Работа была мотивирована энтропийными задачами; мы предположили, что такие задачи могут быть не столь важными, по сравнению с энтальпийными вопросами, возникающими из неблагоприятных пространственных взаимодействий. Более длинные линкеры также, конечно, снизят энтальпийные убытки, обеспечив доступ к большему множеству конформаций.

Тун и коллеги измерили связь нескольких мультивалентных лигандов с В-субъединицей SLT. Несмотря на то, что многие лиганды обеспечивают достаточные улучшения в активности по сравнению с их моновалентными аналогами, механизм улучшений зависит от природы связующего звена. Калориметрическое измерение связи двух бивалентных, С-связанных пептид-сопряжённых лигандов, которые определяли через твёрдо-фазный фильтр, показало, что в то время, пока один лиганд явно функционирует через механизм хелатного типа, другой проявляет свою активность через агрегационный процесс. Здесь направление связывания контролируется природой пептидного линкера; если гидрофобный линкер даёт связывание хелатного типа, гидрофильный линкер подавляет этот режим связывания и приводит к образованию агрегатов. Ароматические разветвлённые лиганды предоставили сильные улучшения в видимой аффиности во время исследований посредством изотермической титрационной калориметрии (ИТК). Эти улучшения в свободной энергии сопровождались уменьшением энтальпии связи, явление, которое мы прежде связали с агрегацией. ИТК исследования с различными концентрациями белка и масс спектрометрическое измерение связывания лиганда продемонстрировало то, что улучшения в видимой активности были полностью присущи агрегации. Эти исследования обеспечили необходимый благоприятный задаток относительно развития моделей связывания, основанных на единственном анализе активности.

Самые впечатляющие выигрыши в активности на 1 моль сахаридного основания наблюдаются у полимерных лигандов; многие из этих лигандов обладают достаточной длиной, чтобы охватить два места связи на единичном лектине, и хелатная модель связывания должна быть хотя бы принята во внимание. С другой стороны, из-за хорошо известной склонности полимерных гликозидов к агрегации и осаждению широкого диапазона мультивалентных лектинов, инициирование хелатного связывания требует дополнительных посторонних проявлений помимо выступления в одном методе связывания. Кисслинг и коллеги приготовили серии полимерных маннозидов и обнаружили впечатляющее повышение активности по методу HIA относительно конканавалина А в роли функции средней степени полимеризации или промежутка между концевыми остатками. Достижение максимальной активности, похоже, соответствует средней длине, достаточной для того, чтобы связать два места связывания лектина. В согласовании с другими наблюдениями о том, что потери в конформационных степенях свободы могут быть не так важны, как считалось ранее, лиганды с различными гибкостями показали примерно одинаковую активность. Интерпретация исследований о связывании осложнена сложной смесью стереоизомеров, находящейся в контрольном образце. Аналогично, реальная длина линкера, требуемая для охватывания двух мест связывания на конканавалине А, неясна. Обычно применяют значение дистанции между местами в 65 Å, которое является кратчайшим расстоянием, которое описывает хорду дуги, которую линкер должен занять на поверхности белка, чтобы получить доступ к двум местам одновременно. Однако, результаты провокационны и, по крайней мере, соответствуют связыванию хелатного типа, если не однозначно соответствуют этой модели. Не существует доказательства, что другие полимерные лиганды функционируют через связывание хелатного типа, хотя они, в общем, могут это делать.

Возможно, наиболее впечатляющий образец улучшения аффиности, включающего хелатную связь, был открыт Бандлом и коллегами.Они представили десятивалентный лиганд, получивший название STARFISH (морская звезда), который ингибирует SLT в методе обнаружения специфических антител с улучшением в 10⁶ раз, по сравнению с моновалентным лигандом, опять же на валентно скорректированном основании. Кристаллографический анализ комплексной связи выявил перекрёстную связь двух пентамеров В-субъединиц посредством десятивалентного лиганда (Рисунок 18); лиганд, таким образом, проявляет активность как по хелатному, так и по агрегатному механизму. Энергетическое влияние каждого эффекта – внутримолекулярного хелатного связывания и агрегации двух белков – неясно. Также неизвестно, однозначно ли эти частицы представлены в растворе; есть вероятность того, что образуются более сложные агрегаты, или что при низких концентрациях белка комплекс 1:1 всё ещё образуется при высокой аффиности. В случае лигандов Фэна, STARFISH лиганд использует связующие звенья значительно длиннее, чем требуется для того, чтобы охватить два места связывания в протяжённой конформации. Несмотря на существование достаточных примеров для недвусмысленных выводов по поводу взаимосвязи длины линкера и аффиности, результаты в целом могут указать на важные детали для конструирования высоко-аффиных лигандов.

Выводы

Много патологических явлений содержат белково-углеводное распознавание. Низкая аффиность моно- и олигосахаридных лигандов углеводов, связанных с белками, делает тщетными усилия по созданию углеводной терапии, которая действовала бы через ингибирование патологического распознавания и адгезии. В настоящее время кластерный гликозидный эффект – улучшение активностей валентно-скорректированного связывания мультивалентных сахаридных лигандов – хорошо известно. Механизмы, из-за которых лиганды ведут себя таким образом, лишь только начинают появляться на горизонте. Наиболее важный механизм действия этих лигандов, известный на сегодняшний день – это агрегация; мультивалентные лиганды связываются крест-накрест и осаждают мультивалентные лектины. Строгие требования, накладываемые структурой лектина и природой белково-углеводного взаимодействия, а именно слабые активности моновалентного связывания и большие дистанции между местами связывания, делают создание мультивалентных лигандов, которые связываются с высокой аффиностью во внутримолекулярном приближении устрашающей задачей. В дополнение к этому, каждое средство, из используемых для оценки белково-углеводных взаимодействий, оценивает ряд разных процессов, либо потому, что средство само по себе измеряет явление, которое включает дополнительные взаимодействия помимо обычного связывания, или потому, что эти средства работают в разных концентрационных режимах. Оценка связывания посредством разнообразных техник способствует лучшему пониманию молекулярной основы, посредством которой мультивалентные лиганды проявляют свои эффекты.

С этой точки зрения кажется разумным предположение в отсутствии опровержения о том, что улучшения в активности, по сравнению с моновалентными лигандами, происходит из-за агрегации и/или осаждения. С другой стороны, недавние работы с высоко-аффиными лигандами для бактериальных двухкомпонентных токсинов являются многообещающими и предполагают, что создание биологически активных высоко-аффиных лигандов не является невозможной задачей. Дополнительные изучения низкомолекулярных моделей соединений в водных растворах нужны для того, чтобы лучше понять энергетическое влияние мультивалентного связывания. Роль образования малых кластеров в создании стабильных комплексов и, как следствие, эффективных высоко-аффиных лигандов остаётся неясной и требует дальнейшего изучения. Наконец, роль дополнительных механизмов действия, включая пространственную стабилизацию, требует дальнейшего прояснения. В совокупности эти исследования обеспечат основу, на которой можно будет рассматривать общее явление ассоциации в водных растворах, в дополнение к основной задаче синтеза полезных биологических соединений.

Дата добавления: 2015-07-16