Масс спектрометрія

Масс спектрометрія – фізичний метод, який дозволяє характеризувати молекули, визначаючи маси їх іонів. Застосування цього методу в біології включає:

· Швидка ідентифікація компонентів складної суміші білків.

Для проведення цього суміш білків спершу піддають двомірному електрофорезу, після чого виділені білки розщеплюють трипсином для утворення фрагментів величиною 800 – 4000 амінокислотних залишків. Таким чином з білкової молекули з середньою довжиною 500 амінокислотних залишків отримують близько 50 триптичних фрагментів. Спектрометр визначає маси фрагментів з високою точністю, при цьому формується список мас фрагментів (відбитки пальців пептидних мас, peptide mass fingerprint), що характеризує білок.

· Cиквенування білків та нуклеїнових кислот, включаючи аналіз популяцій на предмет наявності генетичних варіації.

Фрагментація пептидів продукує суміш іонів, які відрізняються за масами окремих амінокислот. Амінокислотна послідовність при цьому встановлюється з аналізу масс-спектру.

· Аналіз посттрансляційних модифікацій чи замін, що відбуваються у визначеній послідовності.

Масс спектрометрія нуклеїнових кислот надає дуже точну та високотехнологічну техніку для кількісного аналізу послідовностей РНК і ДНК в окремих осіб популяції. Практичні застосування цього методу включають:

Ø визначення частоти алелей у популяції чи встановлення алелей осіб з однонуклеотидним поліморфізмом (SNP);

Ø характеристика окремих генотипів;

Ø встановлення гаплотипу (дискретні комбінації однонуклетидного поліморфізму) осіб;

Ø встановлення абсолютного рівня експресії генів з похибкою до 3 %;

Ø неінвазивна пренатальна діагностика;

Ø геномне сиквенування.

Конкретним прикладом застосування даних, отриманих поєднанням знань геноміки, протеоміки та структурних методів, є встановлення механізмів резистентності бактерій туберкульозу проти антибіотиків. Протягом свого життєвого циклу бактерії туберкульозу пристосувались до впливу макрофагів (які є основною лінією захисту проти бактеріальної інфекції), набувши клітинну стінку, непроникну до різних цитотоксичних впливів макрофагів, включаючи низьке рН та оксидативний стрес. Водночас, бактерії здатні змінювати власну генну експресію, щоб пристосувати власний метаболічний рівень до оточуючих умов. Після десятиліть зниження рівня захворюваності на туберкульоз внаслідок розробки дієвих ліків, з середини 80-х років минулого століття захворюваність знову почала різко зростати, причиною чого стала поява резистентних штамів.

Первинними протитуберкульозними ліками був ізоніазид (гідразид ізонікотинової кислоти), який викликає загибель бактерій, порушуючи синтез їх клітинної стінки. Мішенню дії ізоніазиду є NADH-залежний транспортний білок еноїл-ацил редуктаза (InhA) β-кето-ацил АСР синтаза (KasA), які беруть участь у синтезі мікоєвої кислоти – основний компонент клітинної стінки. Після проникнення у клітину ізоніазид повинен перетворитись в активну форму під дією фермента KatG, природною функцією якого є знешкодження пероксидів.

Для встановлення молекулярних механізмів резистентності бактерій туберкульозу було застосовано декілька методів:

Ø Встановлення змін у генній експресії. При дослідженні звичайних та резистентних штамів було встановлено значна зміна в експресії двох класів генів. Один набір генів включав гени синтезу клітинної стінки (включаючи компоненти комплексу синтази жирних кислот), інший – алкіл гідропероксид редуктаза, яка забезпечує розвиток оксидативного стресу. Логікою виявилось те, що бактеріальна клітина розпізнає ефект лікарського препарату і намагається компенсувати зниження ферментативних активностей, посиленням експресії генів.

Ø Мутації, що забезпечують стійкість до ізоніазиду. При дослідженні генів резистенних бактерій туберкульозу встановлено, що більшість з них мала мутації або в гені KatG, що забезпечувало відсутність активації ізоніазиду, та гені InhA, що дозволяло уникати інгібування.

Ø Кристалографія. При дослідженні структури комплексу активованого ізоніазиду з InhA було встановлено, що препарат ковалентно приєднаний до нікотинамідного кільця NAD, приєднується до активного центру InhA і утворюється адукт, який забезпечує інгібування. При відсутності інгібітора фермент може зв᾽язувати спершу або субстрат або кофактор. Оскільки субстрат займає той самий сайт у ферменті, що і інгібітор, тому інгібіторний комплекс може сформуватись лише коли спершу приєднується кофактор. Якщо спершу зв᾽язується субстрат інгібіторний комплекс не може утворитись, але якщо першим зв᾽язується кофактор – утворюється стабільний інгібіторний комплекс, який виводить фермент з метаболічного ланцюга. Фермент мутантного штаму має має знижену афінність до NADН, що сприяє зв’язуванню субстрату спершу та дозволяє уникати інгібування.

---

Дата добавления: 2015-11-16