Direct Examination

Модуль1

1. Визначення вірусів

Віруси– облігатні внутрішньоклітинні паразити або симбіонти, які мають власні геноми, що кодують інформацію, необхідну для вірусної репродукції, і відповідно, мають певну ступінь автономії від генетичних систем хазяїна, - але не кодують всю систему трансляції та мембранного апарату.

1) мають нуклеїнову кислоту одного типу,

2) репродукуються в формі генетичного матеріалу,

3) не здатні до росту та біномінарного ділення

4) у них відсутня “система Ліпмана” (одна з ферментативних систем, яка приймає участь у виробництві енергії).”

n Відсутність власних білок — синтезуючих систем;

n Відсутність росту та диз’юнктивний спосіб збірки

2. Віруси ЖИВІ чи НЕЖИВІ

Властивості, за якими віруси відносять до живого:

Віруси володіють тими властивостями, які притаманні усім іншим формам життя:

розмноження,

спадковість

мінливість (пристосованість до умов оточуючого середовища)

Вони займають конкретну екологічну нішу

Властивості, за якими віруси відносили до неживого:

1. Відсутність своїх білок синтезуючих систем

2. Відсутність росту

3. Диз”юнктивний спосіб збірки

4. Один тип НК

5. Можливість кристалізації

6. Існування вірусоідів, віроідів та пріонів

7. Можлива інтеграція з клітинним геномом

3. Відкриття вірусів Д.Й. Івановським (характеристика експериментів)

12-го лютого 1892 р. Дмитро Івановський, асистент Петербурського університету, подає на розгляд Імператорської Академії Наук Петербургу роботу, яка показує, що витяжка від уражених рослин тютюну може передавати хворобу іншим рослинам після проходження через керамічні фільтри достатньо малого діаметру, щоб затримати найменші відомі бактерії.

Ця подія загалом визнається як початок Вірусології. На жаль, ні Івановський, ні наукове суспільство того часу повністю не реалізовують значення цих результатів. (1903 – захист дисертац. роботи)

4. Роль Д.Й. Івановського та М. Бейєринка в становленні вірусології

див. питання 3

Ивановский, несомненно, принадлежит к выдающимся ученым нашего времени: ведь ему удалось сделать не только величайшее открытие, но и основать совершенно новую науку - науку о вирусах. Доказав существование фильтрующихся инфекционных агентов, Ивановский нашел метод, с помощью которого можно было отличить возбудителей вирусных заболеваний.
Рассматривая под микроскопом зараженные листья растений табака, Ивановский обнаружил мельчайшие кристаллы. Он правильно решил, что они связаны с проникновением возбудителя в растение. Лишь через несколько десятилетий ученые доказали способность многих вирусов формировать кристаллы внутри зараженных клеток при различных заболеваниях не только у растений, но и у животных.

После открытия Ивановского датский микробиолог М. Бейеринк повторил его опыты и подтвердил, что агент, вызывающий мозаичную болезнь табака, свободно проходит через фарфоровые фильтры. В противоположность Мейеру и Ивановскому Бейеринк отверг мысль о связи болезни с бактериями и выдвинул идею, что это «жидкий живой контагий».

Бейеринк был весьма скрупулезным исследователем. Его не удовлетворяли результаты фильтрования сока больных растений, и, чтобы полностью отвергнуть роль микробов в возникновении болезни, он предпринял другой эксперимент.

Полученный от больных растений сок Бейеринк поместил на поверхность плоской чашки с плотным слоем агара (его приготовляют из экстракта морских водорослей). Благодаря высоким питательным свойствам агара микробы развиваются на его поверхности, образуя колонии. Проникнуть в глубь этого желеподобного вещества ни один микроб не может.

Через несколько дней Бейеринк снял верхний слой агара, где действительно выросли колонии микробов, и использовал для заражения здоровых растений средний и нижний слои, куда микробы проникнуть не могли. Предположения подтвердились: какое-то вещество, попавшее в глубь агара, вызвало мозаичную болезнь в зараженных листьях.

После этих опытов Бейеринк написал, что причиной болезни «является вирус, который скорее всего находится в жидком или растворенном состоянии и не является плотной частицей».

Через два года германские микробиологи Ф. Лефлер и П. Фрош показали, что ящур, эпидемическая болезнь крупного рогатого скота, также вызывается фильтрующимся агентом - вирусом, а в 1901 году В. Рид и его сотрудники установили, что возбудитель желтой лихорадки, тяжелейшей тропической болезни людей, также проходит через фильтры и является вирусом.

Мартін Бейєрінк підтвердив та розширив експерименти Івановського з вірусом мозаїки тютюну і був першим, хто розвинув сучасне уявлення про вірус, який він визначив як

contagium vivum fluidum (розчинний живий мікроб).

Незалежно від Івановського, в 1898 році Бейерінк повторив його експерименти по фільтрації екстрактів із рослин тютюну, які були вражені захворюванням тютюнової мозаїки. У той час віруси були невідомі і в своїй роботі Бейерінк слідував по стопах свого колеги Адольфа Майера в Вагенінгене, який опублікував десятиліттям раніше першу публікацію по тютюновій мозаїці і зробив неправильний висновок щодо бактеріальної природи патогена. Як і Івановський, Бейерінк показав, що фільтрація не допомагає утримати збудника захворювання тютюнової мозаїки на керамічних фільтрах Чамберлена, які володіли найменшими на той час порами і вважалися стандартом для ультрафітраціі розчинів від бактеріальних організмів. Бейерінк також показав, що патоген здатен репродукуватися і поширюватися в клітинах господаря, але не може бути культивований в розчині подібно бактеріям. На відміну від Іванівського, який продовжував вважати, для позначення особливої, небактеріальних природи збудника.

Бейерлінк, проте, дотримувався гіпотези про те, що вірус є якоюсь рідкою матерією, називаючи вірусний розчин сontagium vivum fluidum - заразною живою рідиною. Дане уявлення про віруси, не як про частинки, а розчинної матерії, втім, було спростовано незабаром після смерті Бейерінк.

.

5. Модельні системи, що використовуються в вірусології

Модельні системи — системи, що використовуються як моделі для вивчення властивостей, процесів та явищ в живій природі (оскільки вони мають багато спільного з іншими живими системами, які ще не так добре вивчені; результати вивчення модельних систем можуть на них екстраполюватися).

n тютюн- вірус тютюнової мозаїки

n бактерія E. coli –бактеріофаг Т4

n курячий ембріон – вірус грипу

n Новонароджені білі миші – вірус поліомієліту

n Культура клітин HeLa – аденовірус

6. Основні методи дослідження вірусів

№	Назва	ХАРАКТЕРИСТИКА	МЕТА
	Мікроскопічний метод	Застосування електронних мікроскопів	Використовується для вивчення будови вірусів
	Метод культури тканин	Зараження вірусом живих клітин, які вирощують у штучному середовищі	Вивчення взаємодії вірусів з клітинами
	Серодіагностика	Полягає у здатності антитіл сироватки крові людини і тварин специфічно реагувати із відповідними антигенами	Використовується для виявлення вірусних захворювань у живому організмі
	Ультрацентрифугування	Розділення частинок розчину під впли-вом відцентрової сили ультрацентрифуги	Встановлення молекулярної маси вірусних частинок
	Електрофорез	Рух позитивно заряджених частинок до катоду, а негативно заряджених – до аноду у постійному електричному полі	Використовується для розділення і вивчення білкових компонентів вірусу

Прямые вирусологические методы исследования позволяют обнаружить вирус, вирусную нуклеиновую кислоту или вирусный антиген непосредственно в клиническом материале и являются, таким образом, наиболее быстрыми (экспресс-методы – до 24 ч). Данные методы менее информативны и требуют лабораторного подтверждения непрямыми методами диагностики в связи с нередким получением ложноотрицательных или ложноположительных результатов. К прямым относятся следующие методы исследования:

· электронная микроскопия с окрашиванием вирусов методом негативного контрастирования (позволяет определить наличие вируса и его концентрацию в материале при условии, что в 1 мл содержится не менее 105 вирусных частиц);

· иммунная электронная микроскопия, основанная на взаимодействии специфических антител с вирусами с образованием комплексов, которые легче обнаруживаются при негативном контрастировании, нежели вирусы отдельно;

· твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) с использованием меченных ферментами антител, которые связываются с антигенами, образуя комплексы, выявляемые при добавлении субстрата для использованного фермента;

· реакция иммунофлюоресценции (РИФ) – прямая или непрямая – основана на применении антител, связанных с флюоресцентным красителем;

· радиоиммунный анализ (РИА) основан на использовании меченных радиоизотопами антител и гамма-счётчиков;

· цитологические методы основаны на микроскопическом исследовании окрашенных мазков, биоптатов, материалов аутопсии;

· молекулярные методы – молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот и полимеразная цепная реакция (первая основана на выявлении комплементарных нитей нуклеиновых кислот с помощью метки, вторая – на принципе репликации вирусспецифической последовательности ДНК в три этапа).

Существует три варианта молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот – точечная гибридизация, блот-гибридизация (используется для диагностики ВИЧ инфекции) и гибридизация in situ (непосредственно в инфицированных клетках). ПЦР (полимеразная цепная реакция) на сегодняшний день всё шире применяется в мониторинге и диагностике вирусных инфекций в связи с высокой чувствительностью и специфичностью данного метода.

Непрямые методы. Данные методы основаны на выделении и идентификации вируса. Это более трудоёмкие и длительные методики, однако, более точные. Материалом для таких исследований может быть содержимое везикул, соскобы (при ветряной оспе, герпетическом поражении кожи и слизистых оболочек), носоглоточный смыв (при респираторных инфекциях), кровь и ликвор (при арбовирусных инфекциях), фекалии (при энтеровирусных инфекциях), смывы (при кори, краснухе и др.). В связи с тем, что вирусы способны размножаться только в живых клетках, культивирование вируса осуществляют в культуре ткани, курином эмбрионе или в организме животного (хомяка, белой мыши, собаки, кошки, некоторых видов обезьян). Индикацию вируса проводят по цитопатическому действию, в реакции гемадсорбции, по цветной пробе, по результатам реакции торможения гемагглютинации, по изменениям или их отсутствию в куриных эмбрионах или культурах ткани, по выживаемости чувствительных животных.

Серологічні: радіоімунологічний аналіз, імунофлуоресцентний аналіз, ІФА, імунодифузійні тести.

n Візуальна діагностика (?)

n Пряме вивчення (Direct Examination)

n Непряме вивчення (Virus Isolation)

n Серологія (?)

Опосередковані дослідження вірусу

n Методи виділеня, накопичення вірусів на різних модельних системах

n Виділення та дослідження нуклеїнової кислоти та білків вірусів

n Електрофорез білку та нуклеїнової кислоти

n Ультрацентрифугування

n Рентгеноструктурний аналіз

n Гібридизація нуклеїнових кислот

n Полімеразна ланцюгова реакція

Direct Examination

1. Детекція антигенів - іммунофлуоресценція, ELISA etc.

2. Електронна мікроскопія - морфологія віріонів

імунна електронна мікроскпія

3. Світлова мікроскопія - гістологічні дослідження

включення

4. Генетична детекція - молекулярна гібридація полімеразна ланцюгова реакція (PCR)

Дата добавления: 2015-11-14