|
Читайте также: |
│ к АБП │ │ полиуглеводную среду │
└────────────────────────────────┘ └──────────────────────┬────────────┘
/\ │
│ \/
└────────────────────────── Инкубация при 37 град. С 18-24 ч
Рис. 2. Схема бактериологического исследования крови
пациентов с лихорадкой неясного генеза
Ход дальнейшей идентификации культуры по культурально-морфологическим, ферментативным свойствам и серологической характеристике изложен далее в соответствующих разделах.
9. Бактериологическое исследование испражнений
Пробы испражнений отбирают сразу после дефекации из дезинфицированного и тщательно вымытого судна, на дно которого был помещен лист плотной чистой бумаги. Материал собирается с помощью ложки-шпателя, вмонтированного в крышку стерильного контейнера. В отсутствие контейнера со шпателем для отбора материала используют любой стерильный инструмент (стерильный деревянный шпатель, проволочная петля, ложечка и т.п.). При наличии патологических примесей необходимо выбрать участки, содержащие слизь, гной, хлопья, но свободные от крови. Образцы жидких испражнений отбирают с помощью стерильной пластиковой пастеровской пипетки с замкнутым резервуаром.
Объем забираемого материала должен быть не менее 2 г. Оптимальным является взятие материала в случае оформленного стула в объеме грецкого ореха; в случае жидкого стула его слой в контейнере должен быть не менее 1,5-2,0 см. Материал, помещенный в стерильный контейнер, доставляется в лабораторию в течение 2 ч.
Если материал невозможно доставить в лабораторию в течение 2 ч, его собирают в консервант (транспортную систему со средой). Объем материала не должен превышать 1/3 объема среды.
Испражнения должны быть тщательно гомогенизированы в среде. Образцы могут храниться до начала исследования в течение суток в условиях холодильника (4-6 град. С).
Транспортные среды и консерванты, используемые для выделения возбудителей брюшного тифа и паратифов A, B и C, а также других возбудителей острых кишечных инфекций, представлены в табл. 1.
Пробы испражнений, собранные непосредственно из прямой кишки с помощью ректального тампона, используют преимущественно для объективизации диагноза (МУ 4.2.2039-05). Взятие материала осуществляется средним медицинским персоналом. Как правило, специальный зонд для взятия мазка входит в состав транспортной системы. Важно отметить, что попадание транспортных сред на слизистую прямой кишки недопустимо! Поэтому ректальный тампон должен погружаться в транспортную среду только после взятия материала. Больного просят лечь на бок с притянутыми к животу бедрами и ладонями развести ягодицы. Зонд-тампон вводят в задний проход на глубину 4-5 см и, аккуратно вращая его вокруг оси, собирают материал с крипт ануса. Осторожно извлекают зонд-тампон и погружают его в транспортную среду. Транспортирование тампона без среды не допускается.
В лаборатории посев проб испражнений проводят непосредственно на плотные дифференциально-диагностические питательные среды и параллельно на среду обогащения.
Схема бактериологического исследования испражнений представлена на рис. 3.
┌──────────────┐ ┌─────────────────────────┐
│ Нативные │ │ Приготовить суспензию в │
│ испражнения ├─────────────────────>│консерванте в соотношении│
│ │ │ 1:3 │
└──────┬───────┘ └────────────┬────────────┘
\/ \/
Доставить в течение 2 ч Можно сохранять до 12-24 ч
│ в холодильнике
\/ │
┌──────────────────────────────────────┐ │
│ Приготовить суспензию в 0,9%-м ├─────┐ │
│растворе NaCl в соотношении 1:5 - 1:10│ │ │
└───────────────┬──────────────────────┘ │ │
│ ┌─────────────────┼──────────────┤
\/ \/ \/ \/
┌────────────────────────────┐ ┌───────────────────────────────────────┐
│ Плотные среды: ВСА, Эндо, │ │ Обогатительные среды: │
│ Плоскирева, SS-агар, ЭМС │ │ Мюллера-Кауфмана, селенитовая или др. │
│ или др. │ │ Соотношение материал - среда 1:5 │
└───────────────┬────────────┘ └──────────┬────────────────────────────┘
│ │
\/ \/
Инкубация 18-24 ч при 37 град. С. Просмотр через 18-24 ч
│ ВСА - через 24 и 48 ч
│ │
│ \/
│ ┌─────────────┐
│ │Высев на ВСА │
│ └────┬────────┘
│ \/
│ Инкубация при 37 град. С
│ Просмотр через 24 и 48 ч
│ │
\/ \/
┌────────────────────────────────────────────────────────────────┐
│Откол подозрительных колоний на полиуглеводные среды: │
│ВСА - черные с почернением среды. S. Paratyphi A - цвета среды. │
│Некоторые серовары - коричневые. Среды Эндо, Плоскирева, │
│ЭМС - цвета среды; │
│SS-агар - цвета среды с черным центром │
└────────────────────────────┬───────────────────────────────────┘
\/
Инкубация при 37 град. С 18-24 ч
│
\/
┌─────────────────────────────────────────────────────┐
│ Дальнейшая идентификация в зависимости от характера │
│ роста культуры на полиуглеводной среде │
└─────────────────────────────────────────────────────┘
Рис. 3. Схема бактериологического исследования испражнений
Из нативных испражнений готовят суспензию в 0,9%-м растворе хлорида натрия в соотношении 1:5 - 1:10, оставляют на 30 мин. для оседания крупных частиц. После этого одну каплю надосадочной жидкости засевают на чашки с плотными питательными средами и 1 мл суспензии - в среду обогащения (соотношение материал - среда должно быть 1:5).
Испражнения, доставленные в лабораторию в консерванте (транспортной среде), перед посевом должны быть тщательно гомогенизированы в среде, после чего проводят прямой посев материала на плотные среды и среду обогащения в тех же соотношениях, что и нативные испражнения.
Пробы испражнений, собранные с помощью ректального тампона, исследуются аналогично испражнениям, доставленным в консерванте. Следует помнить, что ректальный тампон содержит меньшее количество микроорганизмов по сравнению с нативными испражнениями, поэтому посевная доза должна быть увеличена.
Максимальное выявление S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Paratyphi B и S. Paratyphi С в испражнениях достигается при использовании сред обогащения, хотя у больных в остром периоде заболевания возбудитель достаточно часто выделяют и при прямом посеве. Посев на среды обогащения параллельно с прямым высевом обязателен!
Все посевы инкубируют при 37 град. С на дифференциально-диагностических средах 18-24 ч, на висмут-сульфит агаре - 24-48 ч. Через 24 ч проводят высев со сред обогащения на плотные среды (висмут-сульфит агар или среду Эндо). Колонии, характерные для данных возбудителей, выросшие на плотных средах, отсевают на полиуглеводную среду.
Необходимо отметить, что техника распределения материала по поверхности чашки с плотными средами должна обеспечить рост изолированных колоний типичного вида, по которому можно визуально оценить культуральные свойства микроорганизма.
Для выделения S. Typhi предпочтительнее использовать висмут-сульфит агар (ВСА). Типичные колонии S. Typhi имеют черный цвет и окружены черным или коричневым ободком с металлическим блеском. Однако при обильном росте S. Typhi часто не дает характерного почернения ВСА, поэтому чашки должны быть засеяны так, чтобы обеспечить рост отдельных колоний.
Пробы фекалий можно засевать на стандартные селективные среды для энтеробактерий, разрешенные к применению на территории Российской Федерации. Тем не менее, для выделения S. Typhi предпочтительнее всего использовать висмут-сульфит агар. Ход дальнейшей идентификации культур по ферментативным свойствам и серологической характеристике изложен далее в соответствующих разделах.
10. Бактериологическое исследование мочи
Посев мочи производят для диагностики с первых дней заболевания и вплоть до выписки больного, а также с целью выявления бактерионосительства. Так как при тифе и паратифах выделение возбудителя с мочой происходит периодически и кратковременно, исследования мочи необходимо проводить повторно с промежутками 5-7 дней.
Следует строго придерживаться общих правил сбора мочи, изложенных в МУ 4.2.2039-05. Вне зависимости от способа получения мочи она должна быть доставлена в лабораторию в течение 2 ч. В крайнем случае допускается хранение мочи в течение ночи в холодильнике.
Следует помнить, что в зависимости от химического состава мочи бактерии в ней могут при хранении как отмирать, так и размножаться.
Увеличение срока сохранения материала может крайне затруднить интерпретацию результата.
Производят прямой посев мочи (или осадка после центрифугирования) без предварительного обогащения согласно Приказу МЗ СССР N 535 на плотные дифференциально-диагностические среды, рекомендуемые для сальмонелл, в том числе возбудителей брюшного тифа и паратифов. Параллельно нативная моча засевается в среды обогащения двойной концентрации в соотношении 1:1 или осадок мочи - в среды обычной концентрации. Посевы помещают в термостат при 37 град. С на 18-24 ч, а затем со среды обогащения производят высев на плотные дифференциально-диагностические среды. Колонии, выросшие на плотных средах, идентифицируют по культурально-ферментативным и серологическим свойствам.
11. Бактериологическое исследование желчи
(дуоденального содержимого)
Желчь собирают в три стерильные пробирки или стерильные одноразовые контейнеры раздельно по порциям A, B, C согласно МУ 4.2.2039-05 и доставляют в лабораторию.
Проводят исследование каждой порции (A, B, C) отдельно или готовят смесь из трех порций. Пробы засевают:
- на плотные дифференциально-диагностические среды (ВСА, Эндо, ЭМС или др.) в количестве 0,5 мл;
- в пробирку (флакон) с питательным бульоном в соотношении 1:10. Нет необходимости засевать желчь на среды обогащения, т.к. желчь сама является хорошей питательной средой для возбудителей брюшного тифа и паратифов.
Засеянные среды вместе с остатками желчи инкубируют при 37 град. С.
Через 18-24 ч просматривают посевы на плотных питательных средах (результаты роста на ВСА учитывают через 24 и 48 ч) и делают пересев подозрительных колоний на полиуглеводную среду.
Из питательного бульона производят высевы на плотные дифференциально-диагностические среды.
Из оставшейся желчи в случае отрицательного результата прямого посева делают повторные высевы на плотные дифференциально-диагностические среды через 18-24 ч и на 3, 5, 7 и 10 сутки.
Проводят идентификацию выросших микроорганизмов по культурально-морфологическим, ферментативным и серологическим свойствам.
12. Бактериологическое исследование материала из розеол
Бактериологическое исследование ("соскоб" с розеол) проводят при наличии хорошо выраженных розеол. Материал собирают асептически. Для этого участок кожи над розеолами обрабатывают 70%-м этиловым спиртом, затем протирают ватным тампоном, смоченным стерильным 0,9%-м раствором хлористого натрия, и осушают стерильным тампоном.
Материал для исследования (тканевую жидкость) получают путем скарификации кожи над розеолой с помощью скальпеля. На поврежденную кожу наносят 1-2 капли желчного бульона или изотонического раствора хлорида натрия, смешивают с выступившей тканевой жидкостью и собирают пастеровской пипеткой или аналогичным одноразовым стерильным устройством в пробирку с одной из жидких сред обогащения (желчный бульон, среда Рапопорт и др.). В лаборатории посев выдерживают при 37 град. С 18-24 ч с последующим высевом на плотные дифференциально-диагностические среды (Эндо, ЭМС, ВСА).
Дальнейшее исследование проводят, как при бактериологическом исследовании другого биологического материала.
13. Бактериологическое исследование костного мозга
Хорошо известно, что при лабораторном подтверждении диагноза "брюшной тиф" наиболее результативным является бактериологическое исследование костного мозга (высеваемость возбудителя составляет 90-95%). Даже у пациентов с легкими и стертыми формами брюшного тифа, трудными для клинического распознавания, а также на фоне приема антимикробных препаратов высеваемость миелокультур значительно выше, чем гемокультур.
Однако на практике бактериологическое исследование костного мозга проводится очень редко, только по особым клиническим показаниям при отсутствии других лабораторных данных, подтверждающих диагноз брюшной тиф или паратиф, т.к. эта инвазивная процедура достаточно травматична. Забор материала для исследования проводят только в условиях стационара при наличии соответствующего специалиста.
Материал для бактериологического исследования (аспират) в количестве 0,50-0,75 мл получают асептически, путем проведения пункции грудины (рукоятки или тела) и засевают в пробирку с одной из сред обогащения (желчный бульон, среда Рапопорт и др.).
Если аспират невозможно засеять в среду обогащения сразу после пункции, его собирают в стерильную пробирку и немедленно направляют в лабораторию, где производится посев в среду обогащения. В лаборатории посевы инкубируют при 37 град. С 18-24 ч с последующим высевом на плотные дифференциально-диагностические среды.
Дальнейшее исследование проводят, как при бактериологическом исследовании другого биологического материала.
14. Питательные среды и реактивы
Перечень питательных сред для выделения и идентификации возбудителей кишечных инфекций, в частности энтеробактерий, обширен и неуклонно расширяется. Выбор конкретных сред во многом обусловлен местными экономическими условиями и традициями. Тем не менее, при этом следует руководствоваться несколькими основными принципами.
14.1. В описании питательной среды должно быть указано, что она может быть использована не просто для выявления сальмонелл, а именно Salmonella Typhi и S. Paratyphi A, B и C.
14.2. Следует отдавать предпочтение сухим питательным средам известных производителей по сравнению со средами, непосредственно изготовляемыми в лаборатории.
14.3. Каждая партия питательной среды в лаборатории должна контролироваться с помощью тест-штаммов (внутренний контроль качества).
14.4. Для лабораторной диагностики тифопаратифозных заболеваний и выявления бактерионосителей должны использоваться питательные среды и реагенты, разрешенные к применению на территории Российской Федерации в установленном порядке.
15. Методы изучения ферментативных свойств
В настоящее время для изучения ферментативной активности микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae, включая возбудителей брюшного тифа и паратифов, разработаны, выпускаются и зарегистрированы различные диагностические тест-системы отечественного и зарубежного производства (от наиболее простых классических сред Гисса в пробирках и планшетах до автоматических анализаторов). Если тест-системы позволяют идентифицировать микроорганизм до уровня рода и выявлять особенности ферментативной активности штаммов, то они могут быть использованы для идентификации возбудителей брюшного тифа и паратифов. Методика работы с тест-системами подробно изложена в инструкциях по применению и их следует строго соблюдать.
16. Биологические свойства возбудителей
Возбудители брюшного тифа и паратифов A, B и C относятся к семейству Enterobacteriaceae, роду Salmonella, виду enterica, подвиду I (enterica) и обладают морфологическими, культуральными и ферментативными свойствами, характерными для данного подвида, вида, рода и семейства.
У представителей рода сальмонелл вида enterica исторически сложилась ситуация, когда для обозначения сероваров использовали не антигенную формулу, как у других бактерий, а названия болезней (человека или животных), страны, города или улицы, где они были выделены, и др. Ошибочно считать эти названия видовыми, т.к. они не имеют таксономического статуса. Тем не менее, названия наиболее часто встречающихся сероваров сальмонелл настолько привычны, что заменить их антигенными формулами практически нереально. Поэтому в современной схеме Кауфмана-Уайта при обозначении сальмонелл только вида enterica подвида I вместо видового обозначения используют название серовара, но пишут его с заглавной буквы.
Таким образом, полные названия возбудителей брюшного тифа и паратифов следующие:
- Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi;
- Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A;
- Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi B;
- Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi C.
В обычной практике возможно использование сокращенных вариантов названий:
- Salmonella ser. Typhi или Salmonella Typhi, или S. Typhi;
- Salmonella ser. Paratyphi A или Salmonella Paratyphi A, или S. Paratyphi A;
- Salmonella ser. Paratyphi B или Salmonella Paratyphi B, или S. Paratyphi B;
- Salmonella ser. Paratyphi C или Salmonella Paratyphi C, или S. Paratyphi C.
16.1. Культурально-морфологические свойства
Подвижные грамотрицательные палочки не образуют спор и капсул, факультативные анаэробы хорошо растут на обычных питательных средах.
На простом питательном агаре - слегка выпуклые с ровным краем и гладкой поверхностью, влажные с блеском колонии более 1 мм.
На дифференциально-диагностических средах (содержащих лактозу как дифференцирующее вещество) - прозрачные, бесцветные или голубоватые, а иногда розоватые или цвета среды колонии (среды Эндо, Плоскирева, ЭМС и другие аналогичные среды).
На SS-агаре - колонии цвета среды с черным центром.
На висмут-сульфитной среде - изолированные колонии S. Typhi, S. Paratyphi B - черные с характерным металлическим блеском, среда под колонией прокрашена в черный цвет. Колонии S. Paratyphi A - зеленоватые, светлые в цвет среды, нежные.
Штаммы S. Paratyphi B (возбудитель паратифа B) на мясопептонном агаре могут образовывать по периферии колоний приподнятый слизистый вал. Слизистый вал развивается на 2-5 сутки при хранении посевов при комнатной температуре. Этот признак не является постоянным и диагностическим.
16.2. Ферментативные свойства
Изучение ферментативных свойств проводится в отношении набора углеводов, многоатомных спиртов, аминокислот и других органических соединений, применяемых при идентификации и изучении сальмонелл и других энтеробактерий. Как правило, в практических лабораториях используют небольшое количество тестов, позволяющих идентифицировать основные роды, входящие в семейство кишечных бактерий. Характеристика ферментативных свойств сальмонелл, включая возбудителей брюшного тифа и паратифов A, B и C, представлена в табл. 2.
Таблица 2
ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ СВОЙСТВА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ БРЮШНОГО ТИФА
И ПАРАТИФОВ A, B, C
┌──────────────┬──────────┬────────┬────────────┬────────────┬────────────┐
│ Субстрат │Salmonella│S. Typhi│S. Paratyphi│S. Paratyphi│S. Paratyphi│
│ │ spp. │ │ A │ B │ C │
├──────────────┼──────────┼────────┼────────────┼────────────┼────────────┤
│Глюкоза (газ) │ + │ - │ + │ + │ + │
├──────────────┼──────────┼────────┼────────────┼────────────┼────────────┤
│Лактоза │ - │ - │ - │ - │ - │
├──────────────┼──────────┼────────┼────────────┼────────────┼────────────┤
│Маннит │ + │ + │ + │ + │ + │
├──────────────┼──────────┼────────┼────────────┼────────────┼────────────┤
│Сахароза │ - │ - │ - │ - │ - │
├──────────────┼──────────┼────────┼────────────┼────────────┼────────────┤
│Индол │ - │ - │ - │ - │ - │
├──────────────┼──────────┼────────┼────────────┼────────────┼────────────┤
│Продукция H2S │ + │ + │ + │ + │ + │
├──────────────┼──────────┼────────┼────────────┼────────────┼────────────┤
│Мочевина │ - │ - │ - │ - │ - │
├──────────────┼──────────┼────────┼────────────┼────────────┼────────────┤
Дата добавления: 2015-07-12; просмотров: 54 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая страница | | | следующая страница ==> |
| МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1 страница | | | МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 3 страница |