Т. Маниатис Э. Фрич Дж. Сэмбрук 9 страница

Последовательность, узнаваемая ферментом

Ферменты, вызывающие образование комплементарных липких концов²)

GT 1 (ст)^{АС g}(g) I ^С0(с)С

AGJCT

TGCjGCA

СС J (^)GG

GjGNCC

TTJCGAA

CC 1 (£)GG

GjPyCGPuG

G 1 G(^)CC

CCTAGG

TGGjCCA

GjGATCC

GC(a)GC

TIGATCA

GCCNNNN|NGGC

AjGATCT

QT i (X) (?)AC

GjGTNACC

Асу I³), Asu\P\ Cla\^z\ HpaU*\ TaqW

Accl³⁾_t i4s«II, Clal, Hpall, Taql Тупые⁴ >.

Accl³\ Acyl, C/al, Hpall, Faf/I

Sa/I³⁾, X/ioI³\ Xmal³>

5a«961³⁾

Тупые

£dl, Sg/II, Affrol, 5a«3A, XftoII

BamHI, Bg/II, Mbol, Sau3A, X/ioII aawHI/ВсИ, MM, 5aw3A_? До11

Низкая 60

ClaI 37

Ddel Средняя 37

Dpril Sati3A» 37

Высокая 37

EcoB 37

£coK 37

EtoPi 37

£соКР> 37

£coRl 37

£coRll Л/ttIi /Ip^I * 37

FniMHl Низкая 37

/тг*ШП Thetl» 37

tfael» ₃₇

Нйе Ii» 37

Средняя 37

/feftl» 37

H&Al Высокая 37

^*^aI Cfol Средняя 37

Hindi * 37

HindiI > 37

» 37—55

CCI (*)GG

ATJCGAT Accl³, Acyl, Asyll, Hpall Taql

CJTNAG

G^MeA|TC Тупые

GJAATTC

TGANNNNNNNNTGCT

AACN'NNNNNGTGC

AGACC

О (£) * J TO (?.)»

jAATT £toRI

| CC(j)GG

GCjNGC

CGjCG Тупые

(t)^gg \ ccQ

PuGCGCjPy

GG|CC >

GACGCNNNNNj

CTGCGNNNNNNNNNN')

G(I)GC(I) * С

GCGJC

GTPyjPuAC»

GTPyjPuAC»

AjAGCTT

Фермент	Иэошизо- меры	Ионная сила^1^	Темпера­тура ннк\ бацни, °С
Hinfl		Средняя
Нра\		Низкая
Hpall		>
Hphl
Kpnl
Mbol	Sa«3A	Высокая
Mboll		Низкая
Mnll		Высокая
Mspl		Низкая
Mstl
PstI		Средняя	21—37
Pvul		Высокая
Pvull		Средняя
Rsal		»
Sad	SstI	Низкая
Sad I
Sad 11		Высокая
Sail
Sau3 A		Средняя
5aw961
Smal	Xmal	(1)
Spk I		\ /
Sst I	SacI	Низкая
SstI I		>
Sstlll		Высокая
Taql		Низкая
Thai	FnuDII	>

Продолжение

Последовательность, узнаваемая, ферментом

Ферменты, вызывающие образование комплементарных липких концов²)

GjANTC

GTTJAAC

CJCGG

GGTGANNNNNNNNj

CCACTNNNNNNN¹»

GGTACjC

|GATC

GAAGANNNNNNNNI

CTTCTNNNNNNN')

CCTC

CjCGG

C|C^MeGG

TGCGCA

CTCGAjG

CGATCG

CAG^CTG

GTJAC

GAGCTjC

CCGCjGG

ACGT

GjTCGAC

jGATC

G^M'ATC

G|GNCC

CCCjGGG

GCATG|C

GAGCT1C

CCGCjGG

ACGT

TjCGA

CGjCG

AccI³, Acyl, /IsuII, Clal, Taql

BamHI, Bell, BglII, Xholl

Тупые

>

Ava\*\ Xhol

BamHI, Bell Bglll, Mbol, Xholl

Тупые

AccP\ Acyl, Asull, Clal, Hpall Тупые

ОО

о>

*•

Xbal

Xhol

Xholl

Xmal

Xmalll

Xorll

Sma I Pvul, RshI

Высокая

»

Низкая

TjCTAGA

CjTCGAG

(g) J gatc®

CjCCGGG

CjGGCCG

CGATCjG

AvaP\ Sail

BamHI, Bell, Bglll, Mbol, Sau3A Aval³)

') См. табл. 4.4.

²) В этом столбце приведены ферменты, вызывающие образование концов, которые могут быть сшиты с концами, полученными с помощью ферментов первого столбца. В некоторых случаях, однако, образовавшийся гибридный участок не может быть расщеп­лен ни одним из исходных ферментов. Например, Bglll расщепляет последовательность

i

aVa-t-C-t

т-с t-a-GiA

а Ват HI расщепляет последовательность

G^G-A-T-C-G С-С -Т-A-G|C

Оба фермента приводят к образованию фрагментов ДНК с идентичными выступающими липкими 5'-концами. Эти концы могут быть сшиты вместе С образованием гибридного участка, который не способен узнать ни один из двух ферментов:

A G А-1 - С -С Т-С-Т.A-G G

а

Аналогичная ситуация наблюдается с рестриктазами Sail и Xhol. '

³) При обработке ДНК ферментами, расщепляющими вырожденные последовательности, образуются популяции фрагментов ДНК

с различающимися концевыми последовательностями. Эти концевые последовательности могут сшиваться только в некоторых ком­

бинациях..

*) Фрагменты с тупыми концами, полученные с помощью этих ферментов, могут быть пришиты к любым другим аналогичным

фрагментам.

■ ^ I- л u J. —.................. „ JL IJJ JCJ I- v ■ JU х I Л-¹¹.. ■■■............... '.И* ■,'.¹ ■■. ■...N,1 ¹ _ ■ Л/'МЛ¹.^'-1. JLL4.—

114 ГЛАВА 4

Таблица 4.2. Влияние метилирования, осуществляемого метилазой dam, на расщепление ДНК

Сайт рестрикции		Рестриктаза		GATC^1}	Gme атс
G|GATCC		BamHI			+	+
TJGATCA		Bell				+	—
AjGATCT		Bglll				+	+
|GATC		Mbol				+	—
jGATC		Sau3A				+	+
CGATjCG		Pvul				+	+
PujGATCPy		Xholl				+	+ 4
AT jCGAT		Clal				+	—.2)
TjCTAGA		Xbal				+	—з)
TjCGA		Taql				Н^-	-J-*)
GAAGA		Mboll					—5)
GGTGA		Hphl				+	—в)
G^raeATC		Dpnl					-р)
') «+» обозначает	' наличие разрыва; «—> обозначает отсутствие разрыва.
^2) Когда сайт рестрикции для Clal	входит в	состав последовательности ATCG АТС.
') Когда	сайт	рестрикции	для	Xbal	входит	в состав	последовательности
TCTAG ^meATC.
^4) Когда сайт рестрикции для	Taql	входит в	состав	последовательности TCG^m АТС.
^&) Когда	сайт	рестрикции	для	Mboll	входит	в состав	последовательности
GAAG ^eATCNNNNNN.
^8) Когда	сайт	рестрикции	ДЛЯ	Hphl	входит	в состав	последовательности
-GGTG ^me АТС.
^7) Следует	иметь	в виду, что	фермент Dpnl	расщепляет только	ДНК, метилирован-
ную метилазой	dam.

Таблица 4.3. Влияние метилирования на расщепление ДНК млекопитающих¹)

Расщепляемая последова- Нерасщепляемая после- Ре^стриктаза тельность довательность

Hhal	GCGC	G^meCGC
Hpall	CGGG	C^meCGG
Mspl	CCGGC^meCGG	^meCCGG
Sail	GTCGAC	GT^meCGAC
Taql	TCGAT^meCGA	__ 2)
Xhol	CTCGAG	CT^meCGAG

^J) Van der Ploeg, Flavell, 1980.

^s) Последовательность TCGA расщепляется независимо от того, мети­лирован цитозин min нет.

Метилаза dcm. Этот фермент метилирует атом С⁵ цитозина в последовательностях ⁵'C^meCAGG³' или ⁵'C^meCTGG³' (Marinus, Morris, 1973; May, Hattman, 1975). Метилирование, осуществляе­мое dcm, влияет в основном на работу £coRII. В большинстве случаев это не создает дополнительных препятствий, поскольку

ФЕРМЕНТЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В МОЛЕКУЛЯРНОМ КЛОНИРОВАНИИ Ц|>

BstNl узнает ту же последовательность, что и £coRII (хотя раз­резает ДНК в другой точке последовательности).

Если не представляется возможным заменить £coRII наг то необходимо выделять ДНК из ^ст~-штаммов Е. coli (Marinus, 1973; Backman, 1980; Roberts et al., 1980)..

Помимо четырех обычных оснований ДНК млекопитающих содержит остатки 5-метилцитозина. Они располагаются в основ­ном в направлении к 5'-концу от остатков G. Хотя метилирова­на только часть пар C_PG, общая картина, метилирования высо­коспецифична (Bird, Southern, 1978). Поэтому любая конкрет­ная пара C_PG метилирована либо в большинстве клеток данной популяции, либо в их небольшой части. Влияние метилирования на расщепление ДНК млекопитающих распространенными ре- стриктазами продемонстрировано в табл. 4.3.

РАСЩЕПЛЕНИЕ ДНК РЕСТРИКТИРУЮЩИМИ ЭНДОНУКЛЕАЗАМИ

Для каждого фермента рестрикции существуют оптимальные условия реакции, которые приводятся в описании, прилагаемом фирмбй-йЗГготовителем. Основные переменные параметры — это* температура инкубации и состав буфера. К температурному режиму предъявляются достаточно жесткие требования, тогда как различия между буферами чаще всего лишь незначительны. Чтобы не готовить отдельный буфер для каждого фермента, удобно разделить ферменты на три группы: ферменты, лучше

всего функционирующие при высокой ионной силе; ферменты, для которых желательны ее средние значения; ферменты, функ­ционирующие предпочтительно в буферах с низкой ионной силой..

В соответствии с таким делением необходимо готовить толь­ко три исходных буфера (табл. 4.4),

Таблица 4.4. Буферы, используемые при расщеплении ДНК рестриктирующими эндонуклеазами (мМ)

Ионная сила буфера	NaCl	Трис-HCl, pH 7,5	MgCh	Дитиотрейтол
Низкая
Средняя
Высокая
Примечание.	Поскольку	фермент Smal плохо	работает во всех	приведенных выше
оуферах, для него следует	приготовить специальный буфер следующего состава 20 мМ
KU, 10 мМ трис-HCl, pH 8,0, 10 мМ MgCla и 1 мМ дитиотрейтол.

Обычно все буферные растворы, приведенные в табл. 4.4, го­товят в виде исходных растворов 10-кратной концентрации, ко-, торые можно хранить при 4°С в течение 1—2 нед или при —20 °С неопределенно долгое рремя.

8*

316 ГЛАВА 4

Проведение расщепления ДНК рестриктазами

Реакционная смесь обычно содержит 0,2—I мкг ДНК В объеме 20 мкл или менее.

1. Добавьте воду к раствору ДНК в стерильной пробирке фирмы «Эппендорф» (будем называть ее в дальнейшем эппен- дорфовской) до объема 18 мкл и перемешайте.

2. Добавьте 2 мкл соответствующего буфера 10-кратной кон­центрации и перемешайте, Слегка постукивая по пробирке паль­цем.

3. Добавьте 1 ед. рестриктазы и перемешайте, слегка посту­кивая по пробирке пальцем. (1 ед. фермента — это количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК.за 1 ч в определенном буфере и при определенной температуре в объеме 20 мкл. Как правило, расщепление рестриктазами, про­водимое в течение более длительных периодов времени или при избытке фермента, не приводит к осложнениям, если в препара­те фермента отсутствуют примеси ДНКазы или экзонуклеазы. В имеющихся в продаже препаратах рестриктаз такие примеси обнаруживаются редко.)

4. Инкубируйте смесь при подходящей температуре в тече­ние необходимого времени.

5. Остановите реакцию добавлением 0,5 М ЭДТА, pH 7,5, до конечной концентрации 10 мМ.

Если ДНК анализируют сразу в геле, добавьте 6 мкл Краси­теля в буфере для нанесения I (с. 400), перемешайте смесь встряхиванием и нанесите расщепленную ДНК на гель.

Если обработанная рестриктазой ДНК нуждается в очистке, экстрагируйте ее один раз смесью фенол — хлороформ, один раз хлороформом и осадите этанолом (подробное описание см. на с. 405).

Примечания

Рестриктазы — дорогие ферменты! Связанные с ними затра­ты могут быть сведены к минимуму, если следовать приведен­ным ниже советам.

А. Многие имеющиеся в продаже препараты рестриктаз по­ставляются в виде концентрированных растворов. Часто для рас­щепления 10 мкг ДНК за 1 ч бывает достаточно 1 мкл препара­та. Чтобы отобрать небольшое количество фермента из упаков­ки, быстро коснитесь кончиком стеклянной микропипетки разового пользования (на 5 мкл) поверхности раствора фермен­та. Таким способом можно отобрать всего 0,1 мкл раствора фермента. Или же можно присоединить к шприцу фирмы «Гамильтон» объемом 1 мкл пластмассовый шланг (длиной

ФЕРМЕНТЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В МОЛЕКУЛЯРНОМ КЛОНИРОВАНИИ 117

1 см) и использовать его для отбора объемов 0,1 мкл. После отбора каждой пробы пластмассовый шланг выбрасывают.

Б. Рестриктазы стабильны при хранении при —20 °С в буфе­ре, содержащем 50% глицерина. При проведении расщепления ДНК рестриктазами приготовьте реакционную смесь, содержа­щую все компоненты, кроме фермента. Достаньте из морозиль­ника фермент и сразу же поместите его в лед. При каждом от­боре фермента используйте чистую стерильную пипетку. Загряз­нение фермента ДНК или другим ферментом может привести к дополнительным затратам времени и средств. Работайте как можно быстрее, чтобы фермент находился вне морозильника минимальное время. Сразу же после использования поместите фермент обратно в морозильник.

В. Используйте минимальные объемы реакционной смеси, уменьшая в ней количество воды, насколько это возможно. Про­верьте, однако, чтобы объем внесенной рестриктазы составлял менее Ую конечного объема реакционной смеси, иначе активность фермента может ингибироваться глицерином.

Г. Часто количество фермента может быть уменьшено за счет увеличения времени реакции. При обработке больших ко­личеств ДНК это дает значительную экономию. Для контроля степени расщепления во время реакции можно отбирать не­большие аликвоты и анализировать их в мини-геле (с. 167).

Д. При обработке большого числа проб ДНК одним и тем же ферментом рассчитайте его общее необходимое количество. Отберите нужное количество раствора фермента из упаковки и смешайте его с необходимым количеством воды и буфера (10Х) для рестрикции. Внесите аликвоты смеси фермент — буфер в ре­акционные смеси.

Е. Когда ДНК необходимо обработать двумя или более рест­риктазами, реакцию можно проводить одновременно при усло­вии, что оба фермента функционируют в одном и том же буфе­ре. В противном случае первым следует использовать фермент, функционирующий в буфере с более низкой ионной силой. Пос­ле этого в реакционную смесь можно добавить необходимое ко­личество соли и второй фермент (ферменты) и продолжить ин­кубацию.

Ж. Если объем реакционной смеси при проведении рестрик­ции слишком велик для его нанесения в ячейку геля, ДНК мож­но сконцентрировать следующим простым способом. После оста­новки реакции добавлением ЭДТА добавьте ²/з объема 5 М аце­тата аммония и 2 объема этанола. Охлаждайте в бане с сухим Льдом и метанолом в течение 5 мин, затем процентрифугируйте

5 мин в центрифуге Эппендорф. Отбросьте надосадочную жид­кость, содержащую основную часть белка. Быстро высушите осадок под вакуумом. Растворите ДНК в подходящем объеме буфера ТЕ, pH 7,6 (с. 393).

118 ГЛАВА 4

ДРУГИЕ ФЕРМЕНТЫ,

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В МОЛЕКУЛЯРНОМ КЛОНИРОВАНИИ

Помимо рестриктирующих эндонуклеаз в молекулярном кло­нировании обычно используют и многие другие ферменты. Их свойства описаны в последующих разделах. В некоторых слу­чаях мы приводим прописи с описаниями условий специфиче­ских ферментативных реакций. В других мы отсылаем читателя к руководствам, в которых можно найти прописи нужных ме­тодик. Наконец, для создания полной картины мы даем описа­ние свойств нескольких ферментов, которые иногда использу­ются в молекулярном клонировании, но не являются необходи­мыми для проведения описанных в этом руководстве экспери­ментов. Детальное описание практического использования таких ферментов читатель может найти в цитируемых 'работах.

ДНК-ПОЛИМЕРАЗА I £. coli

Ник-трансляция ДНК

ДНК-полимераза I Е. coli присоединяет нуклеотидные остат­ки к З'-гидроксильному концу, который образуется при разрыве * (по-английски — nick) одной из цепей двухцепочечной молекулы ДНК. Кроме того, благодаря своей 5'-—►З'-экзонуклеазной ак­тивности фермент может удалять нуклеотиды с 5'-конца, обра­зующегося при разрыве. Удаление нуклеотидов с б'-конца раз­рыва и последовательное добавление нуклеотидов к З'-концу приводят к перемещению разрыва вдоль цепи ДНК (ник-транс­ляции) (Kelley et al., 1970). Заменяя нуклеотиды, формирующие цепь ДНК, на радиоактивные, можно получить меченную ³²Р ДНК с удельной активностью, превышающей 10⁸ имп/(мин*мкг) (Maniatis et al., 1975; Rigby et al., 1977).

1. Обычно реакционная смесь содержит 1 мкг ДНК в объеме 50 мкл. Однако реакцию можно проводить и в меньших объемах, вплоть до 5 мкл.

2. ДНК-полимераза I Е. coli может работать в смеси с dNTP в таких низких концентрациях, как 2 мкМ, однако более эффек­тивно фермент синтезирует ДНК при больших концентрациях субстратов. Исходя из соображений экономии, реакции ник- трансляции проводят при минимальных концентрациях (2 мкМ) меченых dNTP и существенно более высоких концентрациях (20 мкМ) немеченых dNTP. Таким образом, в реакционной сме­си объемом 50 мкл содержится 1 нмоль каждого из немеченых dNTP и 100 пмоль каждого из меченых dNTP. Удельная актив­ность полученной в результате ник-трансляции ДНК зависит в

_ о

свою очередь от соотношения в реакционной смеси меченых и немеченых dNTP. Когда требуется высокая (>10⁸ имп/мин на

ФЕРМЕНТЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В МОЛЕКУЛЯРНОМ КЛОНИРОВАНИИ Ц9

120 ГЛАВА 4

1 мкг ДНК) удельная активность ДНК (например, для иссле­дования библиотек рекомбинантных ДНК или для обнаружения уникальных последовательностей эукариотической ДНК при гибридизации по Саузерну) в реакции ник-трансляции должно участвовать по 200 пмоль каждого из четырех dNTP, меченных ³²Р в a-положении (уд. акт. > 800 Ки/ммоль).

Для большинства других целей разумно использовать один dNTP, меченный ³²Р в a-положении, и три немеченых dNTP, или разбавлять каждый [a-³²P]dNTP соответствующим количе­ством немеченого dNTP.

3. Большинство поступающих в продажу препаратов [a-³²P]dNTP выпускается в виде концентрированных водных рас­творов, которые можно непосредственно добавлять в реакцион­ную смесь для проведения ник-трансляции. Удельная активность этих препаратов колеблется от 400 до 2000 Ки/ммоль. При ис­пользовании [a-³²P]dNTP, растворенных в смеси этанол — вода, этанол и воду удаляют, как описано на с. 401.

4. Реакцию ник-трансляции проводят в следующей смеси: 5 мкл буфера (ЮХ) для ник-трансляции, 1 мкг ДНК, 1 нмоль каждого (1 мкл 1 мМ раствора) немеченого dNTP (при необхо­димости), 100 пмоль [a-³²P]dNTP и Н₂0 до объема 44 мкл. Смесь охлаждают до 0°С. Разводят в 10 000 раз небольшое количество исходного раствора ДНКазы (1 мг/мл) в охлажденном буфере для ник-трансляции, содержащем 50%-ный глицерин. Разбав­ленный фермент стабилен при хранении при —20 °С в этом бу­фере (с. 397).

5. Добавляют в реакционную смесь 0,5 мкл разбавленной ДНКазы I (0,1 мкг/мл) и перемешивают с помощью встряхива­ния.

6. Добавляют 5 ед. (Richardson et al., 1964) ДНК-полимера- зы I Е. coli и перемешивают.

7. Инкубируют при 16 °С в течение 60 мин.

Примечание. Если реакцию проводят при более высокой тем­пературе, в результате копирования ДНК-полимеразой новосин- тезированной цепи может образоваться значительное количество «схлопнувшейся» ДНК.

16*С

20 °С

или больше

9. Реакцию останавливают добавлением 2 мкл 0,5 М ЭДТА.

10. Используя связывание с DE-81 или осаждение с помощью

Дата добавления: 2015-08-29