Т. Маниатис Э. Фрич Дж. Сэмбрук 2 страница

СИСТЕМЫ вектор —хозяин 21

\

?

Чашки инкубировали в течение ночи при 37 °С

Отбираемые для дальнейшего анализа
устойчивые к ампициллину,

но чувствительные к тетрациклину
колонии

Рис. 1.2. Выявление вставок чужеродной ДНК по инактивации кодируемых плазмидой генов устойчивости к антибиотикам.

держат плазмиды с активным геном устойчивости к тетрацикли­ну. 1Г'та1ШХТТЛазмйдах вряд ли есть вставки чужеродной ДНК. Те же колонии, которые вырастают лишь на чашке с ампицил­лином содержат плазмиды с неактивными генами устойчивости к. тетрациклину. В этих плазмидах, вероятно, есть чужеродные последовательности ДНК.

В некоторых случаях разработаны методы, позволяющие ис­пользовать положительный отбор для выявления в популяции, в основном устойчивой к антибиотику, тех бактерий, которые к этому антибиотику чувствительны. Пользуясь ими, можно отби­рать рекомбинантные плазмиды, у которых ген устойчивости к антибиотику инактивирован в результате вставки в него чуже­

22 ГЛАВА 1

родной последовательности ДНК. Наиболее удобная из таких систем описана в работах Bochner et al., 1980; Maloy, Nunn, 1981. Эти авторы разработали среды с липофильными хелатны- ми соединениями—фузаровой или хинальдиновой кислотой. На таких средах можно проводить прямой положительный отбор клонов Tet^s из популяции бактерий Tet^s и Tet^r. Для большинст­ва штаммов Е. coli примерно 90% колоний, выросших на среде с тетрациклином и фузаровой кислотой, оказываются Tet^s, если их высевать на среды, содержащие лишь тетрациклин. Таким способом можно из популяции бактерий, трансформированных pBR322 или рАТ153, отбирать такие клетки, которые содержат плазмиды со вставками в сайты для BamHI или Sail.

Аналогичная методика была разработана и для отбора бак­терий, чувствительных к паромомицину (Slutsky et al., 1980). Она позволяет проводить отбор производных рМК16 со вставка­ми в сайтах для Smal или Xhol (Kahn et al., 1979).

Хотя вставка чужеродных последовательностей ДНК в ген устойчивости к антибиотику почти всегда инактивирует этот ген, известен по крайней мере один случай, когда при этом ген ос­тается активным. Вставка сегмента кДНК препроинсулина кры­сы в сайт Psil плазмиды pBR322 не инактивирует ген устойчи­вости к ампициллину (Villa-Komaroff et al., 1978). По-видимому, в этом случае встраиваемый небольшой кусок чужеродной ДНК не изменяет рамки считывания гена устойчивости к ампицилли­ну, и образующийся в результате «составной» белок сохраняет р-лактамазную активность.

Клонирование фрагментов в определенной ориентации

Большинство векторных плазмид содержит по одному уни­кальному сайту узнавания для двух, или, более рестриктирую- щих ферментов. Например, плазмида pBR322 содержит по одно­му саитудля рестриктаз Hindlll и BamHI (рис. 1.3). С по- мощьЙ''Электрофореза в агарозном геле можно выделить боль­ший _фй^1мент ддазмидной ДНК, получающийся'прТРрасщепле- нии ее этими двумя рестриктирующими ферментами, и лигиро­вать его с с^ментом ^жердщой ДНК, липкие концы которого совместимы с концами ]фрагмедт.а, образующегося пр^[ расщеп­лении ферментами 5шпН1 и Hindlll. Получающийся в резуль­тате этого 1ШЛйДед^рскщбдна^^пользуют затем для транс­формации Е. coli в устойчивый к ампициллину штамм. Так как одноцепочечные концы разрывов, вызванных Hindlll и BamHI, некомплементарны друг другу, не может происходить эффектив­ного замыкания в кольцо большого фрагмента вектора, и он трансформирует клетки Е. coli очень слабо. Поэтому большинст­во устойчивых к ампициллину колоний содержит плазмиды с встроенными между сайтами Hindlll и BamHI сегментами чу-

СИСТЕМЫ ВЕКТОР — ХОЗЯИН 23

Hind Ш BamHI Hind Ш

I I 1

ИЛЛЛЛЛАЛАДЛЛЛ

Чужеродная ДНК

BamHI + HmdlS

v

н ев н

<ЛДЛЛЛЛЛ ЦЛЛЛЛЛА,

Низкая эффективность Высокая эффективность трансформации трансформации

Рис. 1.3. Клонирование фрагментов в определенной ориентации.

жеродной ДНК. В зависимости от сегмента чужеродной ДНК и от локализации сайтов рестрикции в векторе можно, конечно, использовать различные комбинации ферментов.

Обработка фосфатазой линейной ДНК плазмиды-вектора

В процессе лигирования (ЦНК-лигаза будет катализировать образование фосфодиэфирной связи между соседними нуклеоти­дами лишь тогда, когда один из них содержит 5'-фосфатную группу, а другой—„З^гидроксильную группу. Поэтому повторное, замыкание в кольцо плазми/шои ДНК можно свести к миниму­му, если удалить S'-фосфаты на обоих концах линейной ДНК

Amp

Hind Ж ^ BomHI

Плазмида-вектор

I

BamHI + Hind Ж

Н

Гель-электрофорез

24 ГЛАВА ]

EcoRI

5^f—►З¹

EcoRI

ОН

ОН

Фосфатаза

он-

ОМ-

ОН

он

/

Не может вновь замыкаться в кольцо

EcoRI EcoRI

1 I

Чужеродная ДНК

5'—► 3’

EcoRt

р

I

ДНК-лигаза

он он

он-

он

он-

он

4-

»

Низкая

эффективность

трансформации

)

Высокая
эффективность
трансформаций ^

Рис. 1.4, Использование фосфатазы для предотвращения повторного замыка­ния в кольцо ДНК вектора.

плазмиды, обработав ее бактериальной щелочной фосфатазой или фосфатазой из кишечника крупного рогатого скота (Seeburg et al.» 1977; Ulrich et al., 1977). В результате ни одна из цепей дуплекса не сможет образовать фосфодиэфирной связи, и в то же время сохранивший 5'-концевые фосфаты сегмент чужерод­ной ДНК можно эффективно лигировать с такой дефосфорили- рованной плазмидной ДНК- В результате образуется открытая кольцевая молекула, содержащая два одноцепочечных разрыва (рис. 1.4). Так как эффективность трансформации колкпеяпй ДНК (даже содержащей одноцепочечные разрывы) гораздо вы-

СИСТЕМЫ ВЕКТОР— хозяин 25

ше, чем линейной плазмидной ДНК, то большинство трансфор- 'мантов будет содержать рекомбинантные плазмиды. Методика обработки плазмидной ДНК фосфатазой приведена на с. 141.

Сложности, возникающие при клонировании в плазмидах больших фрагментов ДНК

Соотношение трансформантов, содержащих рекомбинантные

плазмиды, и трансформантов с повторно... замкнутым в кольцо

вектором может зависеть также от размера встраиваемой чуже­родной ДНК. Как правило, чем больше вставка чужеродной ДНК, тем ниже эффективность трансформации. Поэтому при клонировании больших фрагментов ДНК (>10 kb) особенно важно принять все возможные меры для снижения повторного замыкания в кольцо молекул вектора. Но и в этом случае фон оказывается довольно высоким, и обычно для выявления реком­бинантных трансформантов необходимо использовать гибриди­зацию in situ (Grunstein, Hogness, 1975; Hanahan, Meselson, 1980).

БАКТЕРИОФАГ X

С тех пор как впервые было показано, что бактериофаг X можно использовать в качестве вектора (Murray, Murray, 1974; Rambach, Tiollais, 1974; Thomas et al., 1974), на его основе скон­струировано большое число разнообразных векторов (см. обзор Williams, Blattner, 1980). Чтобы эффективно использовать эти векторы, необходимо знать основы молекулярной биологии бак­териофага К (более исчерпывающую информацию см. в работах Herskowitz, 1973; Hendrix et al., 1982).

^Бактериофаг А, представляет собой вирус, содержащий двух­цепочечную ДНК. Его геном имеет размер около 50 kb (рис. 1.5). ДНК в частицах бактериофага Я, находится в виде линейных двухцепочечных молекул с одноцепочечными компле­ментарными концами длиной по 12 нуклеотидов (липкие концы). Вскоре после проникновения в бактерию-хозяина эти концы сли­паются, ДНК замыкается в кольцо и в течение ранней стадии инфекции транскрибируется уже как кольцевая молекула. В хо­де этой стадии происходит выбор одного из двух альтернативных путей репликации вируса (рис. 1.6). 1. При литическом развитии кольцевая ДНК многократно реплицируется в клетке, синтези­руются большие количества продуктов генов бактериофага, об­разуются и созревают частицы вирусного потомства. В конце концов клетка лизируется, высвобождая много новых инфекци­онных вирусных частиц. 2. При лизогенном же развитии геном инфицирующего бактериофага встраивается в ДНК бактерии-

26 ГЛАВл >

'паковка

ДИК

Упаковка

Дик

Синтез компонентов головки и сборка

Синтез компонентов хвостового отростка и сборка

Область Ь₂, функция неизвестна

1евый конец

;os i

in

1.

о

kb I

t’ И

O'

ию х

I г "I

Ю

° У ь ° ^и

* ^ ГЗ Ci

<Л f. г ^г

^м ^ OJ * *■

15 16 17 18

а >

х а_

о

а

Г

I

20 2f 22

а

а

ж

□

о

>

<1

t=j tn — _ о

25 26 27 28

I i

- сг

" о ^я <л о а

Рис. 1.5. Физическая и генетическая карты бактериофага к дикого типа. Ввер- тического и лизогенного путей развития. Далее приведена генетическая карта, функции каждого из этих генов см. в работе Hendrix et al., 1982). Внизу при- молекулы в тысячах пар оснований (kb). Отмечены сайты расщепления рес- работе Уильямса и Блаттнера (Williams, Blattner, 1980).

хозяина, последовательно реплицируется и передается клеткам- потомкам как обычный хромосомный ген.

Ниже подробнее описаны те гены и их продукты, которые участвуют в этих двух путях развития бактериофага X.

Литический цикл

Немедленная ранняя транскрипция

В начале инфекции транскрипция инициируется на двух про­моторах, p_L и рку которые расположены непосредственно слева и справа от гена с\ (кодирующего репрессор) (рис. 1.7). Терми- нация получающихся при этом «немедленных ранних» РНК про­исходит в конце генов N и его соответственно в сайтах t_L и £ri, хотя рост некоторых правосторонних транскриптов продолжает­ся и далее, через гены О и Р (которые кодируют белки, участ­вующие в репликации ДНК) и заканчивается в сайте t_R2. Лево­сторонний транскрипт кодирует белок N, действие которого не­обходимо для следующей стадии инфекции.

Задержанная ранняя транскрипция

Белок N нейтрализует активность фактора терминации р клетки-хозяина и позволяет транскрипции пройти через ранние терминаторы tu tri и tR2 в остальную область ранних генов. По-

СИСТЕМЫ ВЕКТОР —ХОЗЯИН 27

Интеграция, вырезание и рекомбинация

Иммунность и регуляция

Синтез

ДНК

Регуляция

поздних

генов

' 1

Лизис

хозяина

(г! Я	Р		. Г~
\ -; ^ | а,! а- L.. L Lw	5»	.К	И О '^J 1

Р I ' L I

п

г

L

о

Правый

конец

cosR

29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 Kb

А1\ Г

tv

/'.Г ¹ А" "Г

Л}

ей

о. о T lD!

X X

£

о

СО

CD

а

тз

о:

о

ш

ху указано обычное расположение генов, кодирующих различные функции ли­на которой показано положение отдельных генов бактериофага X (описание ведена физическая карта ДИК фага а. Указаны расстояния от левого конца триктирующими эндонуклеазами. Подробная карта рестрикции приведена в

этому белок N является положительным регуляторным элемен­том, активность которого необходима для литического развитии бактериофага, обладающего сайтом tr₂. Мутанты N~ могут, однако, расти (хотя и относительно плохо), если в результате делеции у них удален сайт Такие фаги называют мутантами nin (^-independent — N-независимыми).

Репликация ДНК

В течение ранней стадии инфекции кольцевая ДНК фага К реплицируется двунаправленно в виде структур Кэрнса (млн 0-форм). Эта репликация начинается в единственной точке ини­циации репликации (оп) (рис. 1.7), для активации которой не­обходимы два кодируемых вирусом белка — О и Р. Позднее начинается репликация по типу катящегося кольца (чем опреде­ляется переход от структур Кэрнса к катящемуся кольцу — неизвестно) и образуются катенированные линейные молекулы ДНК. В процессе упаковки ДНК продукт гена А фага К рас­щепляет эти катенаты в сайтах cosL и cosR, в результате чего получаются те линейные молекулы ДНК единичной длины с липкими концами, которые и оказываются в зрелых частицах бактериофага.

Поздняя транскрипция

Начинающийся с р^ ранний транскрипт кодирует белок его. Накопившись в процессе инфекции, этот белок связывается с оl и Or, подавляет присоединение РНК-полимеразы и тем са-

Лнтический путь

ас.

Линейная ДНК фага \_t проникающая в клетку

Концы цепей в одноцепочечных разрывах сшиваются лигаэой

Двуна-^

праеленная

репликация

/

\\

ЛИЗО! енный путь

Начало синтеза ран них белков

Окончание синтеза ранних- белков: начало синтеза белков интеграции *

Им let pdiиеная рекомбинации

Хромосома £. coii

Конец ин let рации; 'переход к пизогенному состоянию

<5в сМ Ы т-г*г1-

С05

Gtt blO

Начало

синтеза

поэдни*

белков

Окончание син теза ранних белкоь

] 'о Катенирисанныв линейные геномы

Расщеплениэ
белком А

/

Заполнение

г о " о в к и

■ И Ц Ь t

?

кой, необходимо функционирование как ранних так и пояттниу fphL 2?^тия» который указан горизонтальной стрел- тикальной стрелкой, нужны функции лишь ранних генов. ' ^лиз°генного же пути, который указан вер-

in t

Ей] 0

cl

m

о

T~

Q

Л

COS

Kb 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 30 39 40 4; 42 43 44 45 46 4-’ 46 49 5C

I I I 1

I I 1 I

Г • Т"Г" ~|—Г~1—г

I

I

Ш

Задержанные ранние

-{

h

Немедпенные ранние

©

Поздние

Установление
и поддержание
лизогенного
состояния

'м

)

Репрессор с I

Рис. 1.7. Схема регуляции генов бактериофага К. Прямоугольниками над картой указаны те гены или сайты ДНК, которые участвуют в регуляции активности генов фага К (обсуждение функций этих генов см. в тексте). ф про­моторы; >• продукты транскрипции; tu?ri и tn2~~ сайты терминации, зависимой от фактора р; W — продукт

гена N, который снимает терминацию в сайтах tu и Ы₂\ Q — продукт гена Q, активатор поздней транскрип­ции с промотора pn'; — транскрипты, которые кодируют генные продукты, участвующие в установлении

и поддержании лизогенного состояния.

SO ГЛАВА 1

мым выключает транскрипцию с промоторов рь и рr. К этому времени, однако, образуется другой регуляторный белок — Q, причем в количествах, достаточных для того, чтобы началась транскрипция поздних генов. Белок Q действует как положи­тельный регулятор синтеза РНК с промотора р\, который ис­пользуется для транскрипции всей поздней области, содержащей многочисленные гены, ответственные за сборку головки и хво­стового отростка и за лизис клетки.

Сборка

Два основных компонента зрелых частиц — головка и хвос­товой отросток — собираются по отдельности.

Самым ранним из выявленных при сборке головки предшест­венником является «обнесенная лесами» предголовка (рис. 1.8). Дальнейшее созревание предголовок, в ходе которого происходят удаление белка, выполняющего функцию «лесов», и протеолити- ческое расщепление других компонентов, зависит от функциони­рования белка groE бактерия-хозяина. В результате получаются структуры, названные предголовками. На первом этапе упаков­ки ДНК в прсдголовку участвуют два белка, Nu\ и А, которые связываются с катенированной линейной ДНК вблизи левого сайта cos, но не с самим этим сайтом. Затем такой комплекс присоединяется к определенной области предголовки. В присут­ствии белка FI ДНК укладывается внутри предголовки, размер которой при этом увеличивается примерно на 20%. Когда голов­ка оказывается заполненной, снаружи капсида присоединяется белок D («decoration» — белок «наружной отделки»), который «обжимает» головку вокруг ДНК. В процессе упаковки левый и правый сайты cos на катенированной линейной ДНК оказыва­ются рядом у входа в головку, где они и расщепляются наиско­сок под действием ter-функции белка А с образованием липких концов длиной по 12 нуклеотидов. Наконец, заполненные голов­ки объединяются с независимо образованными хвостовыми от­ростками..

Лизис

Для лизиса клетки-хозяина и высвобождения потомства фага необходимы два фаговых белка, R и 5. Особенно часто исполь­зуются мутанты по белку S, так как при этом внутри клеток накапливаются большие количества фаговых частиц и тем са­мым повышается выход фага. Мутанты S~ можно высвободить, лизируя клетки хлороформом.

Лизогенизация

В небольшой части зараженных клеток не развертывается литический цикл, а активируется иной путь развития, приводя­щий к интеграции ДНК фага К в геном бактерии-хозяина. Вы-

f*

D=_E

I =B • = Nu3

<5 =C

gro e

«Обнесенная

лесами»

предголовка

(Белок

Сактерии-

хозяина)

/

•• I;»*

Предголовка

FH

ter

Функциони­рование белка А

Зрелая

фаговая

частица

Молекула

ДНК фага \

единичной

длины

Рис. 1.8. Схема сборки бактериофага к. Указаны белки, функционирующие на каждом этапе сборки (подробности см. в тексте и в работе Hohn, 1979). ^{4 F}

о

•s

ч

м

£

Е

ю

п

>5

ч

о

V

X

О

со

X

со

Дата добавления: 2015-08-29