Т. Маниатис Э. Фрич Дж. Сэмбрук 11 страница

138 ГЛАВА 4

ведено в гл. 7. Обратная транскриптаза также может быть ис­пользована для синтеза на матрицах РНК или одноцепочечной ДНК зондов, применяемых в экспериментах по гибридизации. Затравками в таких реакциях могут служить oligo (dT) (гл. 7) или набор большого числа случайно выбранных олигодезокси- нуклеотидов («рассеянные» олигонуклеотиды; Taylor et aL, 1976). Разнообразие этих олигонуклеотидов достаточно велико, чтобы некоторые из них оказались комплементарными последо­вательностям оснований в матричной нуклеиновой кислоте. Пос­ле гибридизации с матрицей такие олигонуклеотиды служат за­травками для обратной транскриптазы. Поскольку разные оли­гонуклеотиды связываются с разными участками матрицы, все ее последовательности будут представлены в синтезированной ДНК с равной частотой (по крайней мере теоретически). Кроме того, «рассеянные» олигонуклеотиды могут служить затравками при использовании в качестве матрицы любой одноцепочечной ДНК или РНК. В отличие от этого oligo(dT) связываются толь­ко с последовательностями poly (А), что приводит к синтезу ДНК, в которой преимущественно представлены последователь­ности, комплементарные З'-концу мРНК-матрицы.

Приготовление олигодезоксинуклеотидной затравкм

1. Растворите примерно 1 г имеющегося в продаже препара­та ДНК тимуса теленка в 30 мл 20 мМ трис-НС1, pH 7,4, 10 мМ

MgCl₂.

2. Добавьте 2 мг сухой панкреатической ДНКазы и переме­шайте смесь с помощью встряхивания. Вязкость раствора дол­жна быстро уменьшиться.

3. Инкубируйте при 37 °С в течение 30 мин.

4. Добавьте 3 мл 10%-ного SDS и 1,5 мл проназы (20 мг/мл).

5. Инкубируйте при 37 °С в течение 45 мин.

6. Удалите белки с помощью двух экстракций смесью фе­нол — хлороформ.

7. Перенесите водную фазу в пробирку из стекла пирекс. Денатурируйте ДНК нагреванием в течение 15 мин в кипящей водяной бане. Быстро охладите раствор, погрузив пробирку в ледяную баню.

8. Добавьте 0,6 мл 5 М NaCl (конечная концентрация 0,1 М) и нанесите раствор на колонку (свободный объем 20 мл) с ДЭАЭ-целлюлозой (Whatman DE-52), уравновешенную раство­ром 5 мМ трис-НС1, pH 7,4, 1 мМ ЭДТА и 0,1 М NaCl.

9. Промойте колонку приблизительно 300 мл того же буфе­

ра, D₂6o фракций в конце промывания должно быть не более

0, 05. * '

10. Соберите затравку, промывая колонку раствором 5 мМ трис-НС1, pH 7,4, 1 мМ ЭДТА и 0,3 М NaCl до полного элюиро­

ФЕРМЕНТЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В МОЛЕКУЛЯРНОМ КЛОНИРОВАНИИ 139

вания материала, поглощающего при 260 нм. Для этого обычно требуется около 150 мл элюирующего буфера.

11. Сконцентрируйте затравку осаждением этанолом в тече­ние нескольких часов при —20 °С.

12. Осадите затравку центрифугированием (2000 g, 20 мин при 0°С). После высушивания осадка под вакуумом растворите затравку в 1 мл Н₂0. Измерьте D₂бо при разбавлении препара­та в соотношении 1: 1000. Выход затравки колеблется между 5 и 30% от препарата к препарату. Доведите концентрацию за-' травки до 50 мг/мл, разделите препарат на небольшие аликвоты и храните в замороженном состоянии при —20 °С.

13. Проверьте затравку в реакции с обратной транскрипта- зон в присутствии и в отсутствие матрицы (см. ниже). Количе­ство импульсов включившееся в ДНК в отсутствие матрицы, должно составлять менее 1% количества импульсов, включив­шихся в ее присутствии.

Получение гибридизационных зондов при использовании обратной транскриптазы и «рассеянной» затравки

Это наиболее предпочтительный метод для синтеза меченных ³²Р зондов с высокой удельной активностью на матрицах одно­цепочечных ДНК или РНК.

1. Смешайте 1,0 мкг матрицы (‘линейной двухцепочечной или одноцепочечной ДНК или РНК) с 20 мкл воды. Прогрейте смесь при 100 °С на кипящей водяной бане в течение 5 мин. Быстро охладите в ледяной бане.

2. Добавьте 10 мкл раствора ДНК-затравки из тимуса телен­

ка или спермы лосося (50 мг/мл), 20 мкл буфера (5Х) для «рассеянной» затравки, 2 мкл 2 мМ раствора каждого из неме­ченых dNTP, 250 пмоль (100 мкКи) [a-³²P]dNTP (уд. акт.* 400 Ки/ммоль, 200 ед. обратной транскриптазы и Н2О до объема 100 мкл. -;

Буфер (5х) для «рассеянной» затравки имеет состав 0,25 М трис-НС1, pH 8,1, 10 мМ дитиотрейтол, 25 мМ MgCb и 0,2 М КС1.

3. Перемешайте и инкубируйте при 37°С в течение 1 ч.

4. Добавьте 2 мкл 0,5 М ЭДТА. Отделите ДНК от невклю- чившихся dNTP на колонках с сефадексом G-50 обычной хро­матографией или хроматографией с использованием центрифуги­рования (с. 407—410). В ДНК должно включиться около 30% [a-³²P]dNTP.

Примечания.

А. По окончании реакции РНК-матрицы могут быть удалены следующим образом. После добавления ЭДТА (стадия 4) до­бавьте 12 мкл 3 М NaOH и инкубируйте смесь в течение 12 ч

140 ГЛАВА 4

при 37 °С. Щелочной раствор затем можно непосредственно на­нести на колонку с сефадексом G-50, уравновешенную буфером ТЕ, pH 7,6.

Б. Гибридизационные зонды, синтезированные с помощью обратной транскриптазы на ДНК, представляют собой одноце­почечные копии матриц: _

Олигодезоксинуклеотидная затравка

Матрица — одноцепочечная ДНК

к

Однако зонды, получаемые на матрицах РНК, включают и одноцепочечные, и двухцепочечные молекулы, которые синтези­руются с помощью двух различных механизмов:

■ Первая цепь к ДНК

^ Олигонуклеотидная

затравка

3 Матрица—-РНК

РНКаза Н

t

или

\

3' 5'

VV4i

\.

Вторая олигонуклеотидная Синтез второй

затравка ^^{епи без} затравки

Из двух возможных реакций беззатравочный синтез второй цепи протекает с существенно меньшей эффективностью, и молекулы со шпильками составляют менее 2—3% общего количества ме­ченной ³²Р ДНК. При необходимости синтез второй цепи (как беззатравочный, так и с экзогенной затравкой) можно ингиби­ровать, добавляя в реакционную смесь актиномицин D в конеч­ной концентрации 1 мг/мл. В присутствии актиномицина D вклю­чение [a-³²P]dNTP в ДНК уменьшается примерно на 50%.

ФЕРМЕНТЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В МОЛЕКУЛЯРНОМ КЛОНИРОВАНИИ 141

ДЕФОСФОРИЛИРОВАНИЕ ДНК

Концевые 5'-фосфаты могут быть удалены из ДНК обработ­кой бактериальной щелочной фосфатазой (ВАР) или щелочной фосфатазой из кишечника теленка (CIP) (Chaconas, van de Sande, 1980). Значительное преимущество последнего фермента состоит в том, что он может быть полностью инактивирован нагреванием до 68 °С в буфере с SDS, тогда как первый фер­мент термостабилен. В связи с последним обстоятельством ре­акции с ВАР обычно проводят при 68 °С дря подавления актив­ности экзонуклеазы, часто загрязняющей препараты фермента. Для удаления следовых количеств ВАР требуется проводить очистку ДНК с помощью многократных экстракций смесью фе­нол — хлороформ или гель-электрофореза. Поэтому в большин­стве случаев предпочтительнее использовать фермент CIP.

1. Проведите полную обработку ДНК подходящим фермен­том рестрикции. Экстрагируйте ДНК один раз смесью фенол — хлороформ и осадите ее этанолом.

2. Растворите ДНК в минимальном объеме 10 мМ трис-НС1, pH 8,0. Добавьте 5 мкл буфера (10Х) для CIP, Н₂0 до объема 48 мкл и CIP (см. примечание ниже).

Для удаления концевых фосфатов из 1 пмоль 5'-концов ДНК (1 пмоль 5'-концов линейной ДНК размером 4 kb равен 1,6 мкг) 'требуется 0,01 ед. CIP.

Буфер (Юх) для CIP имеет состав: 0,5 М трис-НС1, pH 9,0, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ ZnCl₂ и 10 мМ спермидин.

Для дефосфорилирования выступающих 5'-концов инкуби­руйте смесь при 37 °С в течение 30 мин, добавьте вторую аликво­ту CIP и продолжайте инкубацию еще 30 мин.

Для дефосфорилирования ДНК с тупыми концами или с укороченными б'-концами инкубируйте смесь 15 мин при 37 °С и 15 мин при 56°С. Затем добавьте вторую аликвоту CIP и пов­торите инкубацию при тех же температурах.

3. Добавьте 40 мкл Н₂0, 10 мкл буфера (ЮХ) STE и 5 мкл 10%-ного SDS. Прогрейте при 68°С в течение 15 мин.

Буфер (ЮХ) STE (TNE) имеет состав: 10 мМ трис-НС1, pH 8,0, 1 М NaCl и 10 мМ ЭДТА.

4. Дважды экстрагируйте смесью фенол — хлороформ и дважды хлороформом.

5. Проведите хроматографию водной фазы на уравновешен­ной буфером ТЕ колонке с сефадексом G-50 с использованием центрифугирования (с. 407—410).

6. Осадите ДНК этанолом. Теперь ее можно использовать в реакциях с лигазой или киназой.

142 ГЛАВА 4

Примечания

A. CIP обычно поставляется в виде суспензии в сульфате аммония. Если сульфат аммония не удаляют в конце реакции путем пропускания реакционной смеси через сефадекс G-50, он осаждается этанолом. Для удаления сульфата аммония требует­ся многократное промывание осадка 70%-ным этанолом. Это важно, поскольку ионы аммония ингибируют активность поли- нуклеотидкиназы.

Подготовьте CIP для использования следующим образом:

1) отцентрифугируйте суспензию фермента в сульфате аммо­ния в течение 1 мин при 4°С в центрифуге Эппендорф;

^ 2) отбросьте надосадочную жидкость, а осадок растворите в

минимальном объеме воды; при хранении в таком виде при 4° С фермент стабилен не менее месяца.

Б. Если тепловая инактивация в присутствии SDS оказыва­ется недостаточной, для связывания двухвалентных ионов цин­ка добавьте тринитроуксусную кислоту до концентрации 10 мМ* В отсутствие ионов цинка фермент CIP более термолаби­лен.

НУКЛЕАЗА Ва/31

Нуклеаза Ва/31 постепенно разрушает 3'- й 5'-цепи ДНК* При подходящих условиях можно контролировать степень рас­щепления молекулы линейной ДНК с двух концов.

Скорость отщепления нуклеотидов с 5'- и З'-концов двухце-

ФЕРМЕНТЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В МОЛЕКУЛЯРНОМ КЛОНИРОВАНИИ 143

почечной ДНК под действием Ва/31 определяется по формуле

где М\ — молекулярная масса линейной двухцепочечной ДНК через t минут после начала расщепления; V_m — максимальная скорость реакции (выраженная в молях отщепленных нуклеоти­дов на 1 л в 1 мин); М_п — средняя молекулярная масса натрие­вой соли мононуклеотида (принятая за 330); Ям— константа' Михаэлиса— Ментен (выраженная в молях концов двухцепочеч- ноп ДНК па 1 л); S₀ — моли концов двухцепочечной ДНК/л при / = 0 (остается постоянной, пока значительная часть моле­кул полностью не деградирует).

При концентрации фермента 40 ед./мл 1/_т = 2,4-10^-5 (моль отщепленных нуклеотидов)/(л* мин) и Лм^4,9*10~⁹ моль двух­цепочечных концов)/л.

Если принять, что величина V_m изменяется пропорционально разбавлению фермента, то скорость деградации фрагмента ДНК размером 2 kb в 100 мкл реакционной смеси, содержащей 10 мкг ДНК и 0,5 ед. фермента, равна

— —1,31-10* дальтон/(мин* молекулу ДНК) —

= —19 пар оснований/(мин-молекулу ДНК) =

— —10 пар оснований/(мин* конец двухцепочечной ДНК).

В большинстве случаев (т. е. когда расщепляемые ДНК име­ют в длину менее 10 kb и когда концентрация ДНК в реакци­онной смеси превышает 20 мкг/мл) значением /См в знаменателе уравнения можно пренебречь.

Наличие возможности контролировать скорость расщепления, осуществляемого Ва/31, и тот факт, что для работы фермента абсолютно необходим кальций и поэтому его активность может быть полностью ингибирована EGTA, позволили разработать очень простой метод картирования сайтов рестрикции в неболь­ших фрагментах ДНК (Legerski et al., 1978) (см. ниже).

При проведении реакции с BalSl в разные моменты времени отбирают пробы и переносят их в EGTA. После обработки этих проб подходящими ферментами рестрикции можно наблюдать исчезновение рестриктов в определенном порядке. Используя ДНК, на одном конце которой находятся векторные последова­тельности (с известной рестрикционной картой), а на другом — некартированные последовательности, можно различить фра1-

2 - (:'/40) ■ (2,4• 10~⁵) -330 4.9-10-"+ 1,3-10-

(1/4)-2,4-10^-6-330

1,549-Ю-⁷

ГЛАВА 4

С V; ■■ ’■ _s.

I ■%'.}......

Hf КЛвОТИйЫ #^:' 'ФЛ'^:' * ^ 'Г:

■:i|M:.i^;,..::^.. 'M#! ••*:.

■ Ч^; ' ^! e ■. ^v":

Wi?+y-

-MW

Ш--№

	:
■Щ-^; -v^::^::^::^::^::^::^::^v -
'&V

W^;rt'iP*’‘:W ♦ -Ж» ■

• lAr

■^,:,‘¹ &ii..!': -■ ' У’’ ■. £7 ■'■⁴ ■^:' "*^'^;:^;'■ ■. V■''..:$i^>_;о^'^,₁:

'.-Ш: *

iXm.m.h. I.i I v.^jn;,

1.

S

. _. _... ^Jpu..^,,.,. _t

роченны© мо|^0ку#ы» котс^ые _¥|Щгут..:фт^ |iHT©fH4e<jiiM'

щ||к8РВДр#^1# "^:: " ' " """ ' ' """ """"*'.....................................................

" Щ

.-.■Му.

..р.-* -.-ж/ '-^J W

,/" *'Т*Ш •

W-,...........?:■

■■ ' ^;,,iw

менты, находящиеся на двух концах, и установить порядок рас­положения фрагментов в некартированной ДНК.

ДНК, обработанную Ва/31, можно также использовать и для последующего клонирования. После репарации фрагментом Кленова ДНК-полимеразы Е. coli к ДНК добавляют синтети­ческие линкеры и затем встраивают ее в подходящий плазмид- ный вектор. Таким способом можно получить серию делеций» начиная с определенной концевой точки ДНК.

ФЕРМЕНТЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В МОЛЕКУЛЯРНОМ КЛОНИРОВАНИИ 145*

Картирование сайтов рестрикции в ДНК с помощью нуклеазы Ва/31¹

1. Используя уравнение, приведенное на с. 142, рассчитай­те время, необходимое для отщепления от ДНК требуемого ко- шичества нуклеотидов.

2. Осадите ДНК этанолом. Растворите ее в BSA (500 мкг/мл).

3. Добавьте равный объем буфера (2х) для Ва/31.

Буфер (2х) для Ва/31 имеет состав: 24 мМ СаС1₂, 24 мМ MgCl₂, 0,4 М NaCl, 40 мМ трис-НС1, pH 8,0, и 2 мМ ЭДТА.

4. Инкубируйте при 30 °С в течение 3 мин.

5. Добавьте необходимое количество Ва/31.

6. В соответствующие моменты времени отбирайте пробы из реакционной смеси. Добавьте EGTA (из 0,2 М раствора, pH 8,0) до конечной концентрации 20 мМ. Поставьте пробы в лед.

7. Далее имеются два варианта обработки проб:

а) Для уменьшения концентрации NaCl с 0,2 М до 66 мМ аликвоты пробы можно разбавить в три раза водой. После до­бавления Vio объема буфера для рестрикции (приготовленного без NaCl) добавляют нужную рестриктазу и проводят с ней реакцию в течение необходимого времени. Затем аликвоты ана­лизируют с помощью гель-электрофореза.

Примечание. EGTA специфически связывает двухвалентные ионы кальция и, следовательно, ингибирует активность Ва/31, существенно не влияя на расщепление ДНК рестриктирующими эндонуклеазами.

б) ДНК, расщепленную Ва/31, можно очистить с помощью экстракции смесью фенол — хлороформ и осаждения этанолом. После промывания 70%-ным этанолом осадки ДНК растворяют в подходящем буфере и обрабатывают рестриктазой. Этот метод используют в том случае, когда рестриктаза ингибируется 66 мМ NaCl.

Клонирование фрагментов ДНК, обработанной Ва/31

1. Проведите обработку ДНК нуклеазой Ва/31 в течение не­обходимого времени. Где это возможно, проведите обработку рестриктазами, чтобы убедиться в совпадении реальной скоро­сти расщепления, осуществляемого Ва/31, с вычисленной по фор­муле (см. выше).

Примечания. Часто бывает полезно провести контрольную реакцию с ДНК, для которой известна полная рестрикционная карта. Время, за которое определенные фрагменты исчезают из:

¹ Legerski et al., 1978. 10—164

446 ГЛАВА 4

ГГ '

Фермент pa

ФОО$ ' *

фермента

очень

;¹ пая 7 •< ^ ^: "..

k^: й*^!Г^

■^:" ■ ■;^:.д"_!>г Фериент в небольших количествах расщепляет •' /*,V-^f;\ нуклеиновые кислоты в районе ^

"^,:: '^".; од нсцетючечных разрывов или небольших

i: -

npoOeftoQ {Kroeksr, Kowalski, 1978). Например: • ■'; ■

¹ '■ • ^f ~~~*?--^л -r ^ ^ ■ дНК с одноцепочечным разрывом

■ i-r '.,:-\ -

r- ". ••

рН4.5

:Zrt⁺⁺

ФЕРМЕНТЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В МОЛЕКУЛЯРНОМ КЛОНИРОВАНИИ 147

10*

148 ГЛАВА 4

ФЕРМЕНТЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В МОЛЕКУЛЯРНОМ КЛОНИРОВАНИИ 149

150 ГЛАВА 4

...........;|1©в|«*еразы (не* j

'щ.

У ^У ••'$' '#' -f'?"■ г.. '£• '' ”•■*■:■’•,, s ’ ^■'^;v)■ ''■ _}.. ^Л... '

■■ ^;;^;/■/ /, дик-

-^v £*■':_::Yr ¥■ w' *' i /^;:.< £r*'.=■ u, Jfr'* ^

vy: ^.V,? *’\..'>'.:'^л' j*- '/ -^: •. ' " i*

' ^v'^: <-4-/ / ■„ V;;/^f ■ /■ „-..У*,V;^: / F,-■■ ',.-•* > «,. _v. „■*.,, ^? 4* ■/■-■■1

лоетимераэа

.t^3Zp]dNTP *

■ _v-,»«*?■<+;агй5й5₁

■'- S=- ' --■ ’ ".: ■ ^v '■ - <,-■,*,, ■ У." ■ ■

Ощегшбйие поспедрвательност^й ^ к^^в фрагм^нтЪеДНК, например;

^V:r •V“isp"" *>' ■,^л'>. ‘-. \ j

■ '"'') ’ ^v •;^г'" ¹ |*:■■ s\ ST-;.Г' КШШ

_%,

.. _ry»'

? ь -F N

ininil»!'-

смеси рестриктов, должно соответствовать вычисленной скорости расщепления нуклеазой Ва/31.

Ва/31 активна при таких низких температурах, как 16 °С. Более низкая скорость расщепления ДНК в подобных условиях может оказаться полезней, когда с концов ДНК требуется уда­лить вссго несколько нуклеотидов...

2. Остановите реакцию с помощью EGTA, проведите очист­ку ДНК смесью фенол — хлороформ и осадите ее этанолом.

3. Поскольку отщепление нуклеотидов с 3'- и 5'-концов ДНК происходит не одновременно, в каждый момент времени только часть молекул ДНК в реакционной смеси имеет тупые концы,, подходящие для лигирования. Поэтому ДНК, обработанная Ва/31, должна быть репарирована в реакции достраивания кон­цов с использованием фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I Е. coli (с. 123). Если расщеплению Ва/31 подвергалась намече- ная ДНК, то для облегчения наблюдения за ДНК на последую­щих стадиях (особенно на стадии 6) реакцию репарации следует проводить с одним меченным ³²Р и тремя немечеными dNTP.

ФЕРМЕНТЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В МОЛЕКУЛЯРНОМ КЛОНИРОВАНИИ 151

'lifOT

Ak ^-Г Д S" ^;-L- j-i-fej

Ma^{+ +}

........ •,_v, •'.••^:'^;:;:^:;'^,>л^:'^:'^::;..,

■ TO^i^ii^^:y''^,.^:'\

^'^ЛчГ^!'^ '"'

^:5

■ "Ui

i.

:<-••', • •

■ *,,

■..3

—J ■■"

.WrJ.

'3'

Например:

152 ГЛАВА 4

■>,z

ФЕРМЕНТЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В МОЛЕКУЛЯРНОМ КЛОНИРОВАНИИ 153

154 ГЛАВА 4

шш

ПО 5 -

ипи’РНК,

концу одноточечны*

14м«!Снц&ш,^'^й^ а!_м 1977),'

...

-л- ■. ^::;^:;:?£^::

'Щ

сшива*шя двухцепочечных

... ' ‘ """'. T4

............................... _................................ ^:ilb,._::i97^t'.'

B^ee®®liPSSf'ШШ?® с

4:*: <,; ^::r;:^:\ SftftfTC Г*‘^^^Т -I, ~ ^:::' ’^:. G А ДТ T С ■ ■

■:■.-^TAAO;;,

j^;_:.^^:^..1^^!;^:^;^**■^,:..:■:■ ^:|^’|^ ' ' ' ""' '*''

- -- l К..к. _fV."'; ■:..^.,.. ' ■.:.Kii^ -.7’ ' ■' ■«:::::J:....: j._;. - ^:;.?'•■ v ' j f ' ^;>'^Л \ ¹' ^;i. / '■ ' '''' '!<■ ‘ " - '' ^¹

клонив

.,v,,.....,„,,.,,,.. £со R1

ФЕРМЕНТЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В МОЛЕКУЛЯРНОМ КЛОНИРОВАНИИ 155

156 ГЛАВА 4

4. Присоедините к репарированной ДНК фосфорилированные

синтетические линкеры (с. 354).,

Примечание. После реакции с фрагментом Кленова и перед проведением реакции с лигазой в очистке ДНК нет необходи­мости.

5. Для расщепления линкеров или каких-либо сайтов рест­рикции обработайте ДНК подходящим ферментом (ферментами) рестрикции.

6* Отделите ДНК от фрагментов линкеров хроматографией на сефарозе CL-4B (с. 407—409).

7. Пришейте ДНК к плазмидному вектору, расщепленному подходящим ферментом (ферментами) рестрикции (с. 351).

8. ^чЦроведите трансформацию клеток Е. coli (гл. 8).

Примечание. Нуклеазу Ва/31 не следует замораживать. Хра­ните фермент при 4°С.

Глава 5

ГЕЛЬ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ** АГАРОЗНОМ ГЕЛЕ

Электрофорез в агарозном геле — стандартный метод,, используемый для разделения, идентификации и очистки фрагментов ДНК. С помощью этой простой техникк можно быстро разделить такие смеси фрагментов ДНК, которые не могут быть разделены другими способами, например центрифугированием в градиенте' плотности. Кроме того_г при разделении в геле прямо следят за положением ДНК, так как полосы ДНК в геле можно окрашивать флуорес­цирующим и интеркалирующим в ДНК красителем — бро­мистым этидием в низкой концентрации. Просматривая прокрашенный гель в ультрафиолетовом свете, можно за­метить даже 1 нг ДНК (Sharp et-a4rr~i9?&).

" Скорость миграции ДНК через агарозный гель при электрофорезе определяется пятью главными параметра­ми, рассмотренными ниже.

Размер молекул ДНК/ Молекулы линейной двухцепо­чечной ДНК перемещаются в геле предположительно од­ним концом вперед (ft&her, Dingman, 1971; Aaij, Borst, T972) со скоростями, обратно пропорциональными десятич­ному логарифму их молекулярных масс (Helling et al.,

1974) (рис. 5.1). ^

Концентрщия^гарозри Фрагменты ДНК данного разме­ра перемещаются в геле, содержащем разные концентра­ции агарозы, с разными скоростямцу Между логарифмом электрофоретической подвижности ДНК \i и концентрацией геля т существует прямая/зависимость, описываемая урав­нением

lgn=lg ц₀—К_гт,

где цо — свободная" электрофоретическая подвижность, а константа Кг называется коэффициентом замедления и за­висит от свойств геля, а также от величины и формы дви­жущихся молекул. Таким образом, применяя гели разных

158 ГЛАВА 5

Рис. 5.1. Зависимость скорости движения фрагментов ДНК при электрофорез* в геле от их размеров.

концентраций, можно разделить большой набор фрагмен­тов ДНК, различающихся по размеру.

Количество агарозы Область эффективного разделения

в геле, % линейных молекул ДНК, kb

0,3 60—5

0, 6 20—1

0,7 10—0,8

0, 9 7-0,ь

1,2 6—0,4

1,5 4—0,2

2,0 3—0,1,

^ Конфощация-ДЛЦ!днк, имеющие одинаковую моле- кул^грттуюмассу, но разные конформации, например коль цевая неповрежденная (форма I), кольцевая с одноце-

ГЕЛЬ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗ 159>

почечным разрывом (форма II) и линейная (форма III), ' движутся в агарозном геле с разными скоростями (Thorne, 1966, 1967). Относительная подвижность трех указанных форм зависит главным образом от концентрации агарозы & геле, а также и от таких факторов, как сила тока, ионная сила буфера или плотность сверхспиральных витков в фор- Me^J* (Johnson, Grossman, 1977). В одних условиях форма I "Перемещается быстрее, а в других — медленнее, чем фйр- ма III. Чтобы однозначно определить конформацию ДНК, - необходимо провести ее электрофорез в присутствии воз­растающих концентраций бромистого этидия. С увеличе­нием концентрации красителя число его молекул, связан­ных с ДНК, растет. При этом отрицательные сверхспираль- ные витки в молекулах формы I постепенно исчезают, а скорость движения ДНК в геле уменьшается. При некото­рой критической концентрации свободных молекул краси­теля, когда в ДНК больше не остается сверхспиральных витков, скорость движения формы I достигает минимальной величины. Последующее добавление новых порций броми­стого этидия приводит к образованию положительных сверхспиральных витков, в результате чего подвижность формы I начинает быстро возрастать. Подвижности фор­мы II и формы III в описанных условиях снижаются, хотя и по-разному, вследствие нейтрализации зарядов и увели­чения жесткости молекул ДНК под влиянием бромистого этидия. Для большинства препаратов ДНК, находящейся, в форме I, критическая концентрация бромистого этидия находится в области 0,1—0,5 мкг/мл.

Напряженность эмпирического поля, j При низких на­пряженностях скорость и е р е щенйя ~ф р а г м е н т о в линейной ДНК пропорциональна приложенному напряжению. Одна­ко с увеличением напряженности электрического поля под­вижность фрагментов ДНК с высокой молекулярной массой дифференциально возрастает. Следовательно, с увеличе­нием напряженности область эффективного разделения ДНК в агарозном геле снижается. Максимальное разделе­ние фрагментов происходит при напряженности, не превы­шающей 5 В/см.

5 Состав оснований и температура✓ Электрофоретическое поведение ДНК в агарозных гелях [в отличие от поведения в полиакриламидных гелях (Attett ёГ'а!., 1973)] слабо за­висит от состава оснований ДНК (Thoma^rDav+sr^^TS) или температуры геля. В агарозных гелях в области тем­ператур от 4 до 30 °С изменения относительной электрофо­ретической подвижности фрагментов ДНК разного разме­ра не наблюдается. Обычно электрофорез в агарозных ге­лях ведут при комнатной температуре. Однако следует

100 ГЛАВА 5

Материал, прозрачный
для ультрафиолета,
(1/8 дюйма) только для

.детали А

Рис. 5.2. Система для проведения гель-электрофореза, разработанная в лабо­ратории Дэвиса.

3. Кювета для геля длиной 14,5 см.

Материал: прозрачная акриловая пластмасса толщиной ¹/₄ дюйма (I дюйм = = 2,5 см) или прозрачная для ультрафиолета акриловая пластмасса тол­щиной Ve дюйма.

Список деталей

Обозначение

А

В

С

D

Е

Размер (в дюймах) 7вХ 5^э/4Х5³Д

¹/4Х5³/₄Х1³/₈ VtXS^X 3 'ЛХ 5³ДХ2³/4 'ЛХ2³/₄Х10³/4

Количество

1 (материал, прозрачный для ультрафиолета)

£

II* Кювета для геля длиной 14,5 см.

Материал: прозрачная акриловая пластмасса толщиной ¹/_в дюйма.

Дата добавления: 2015-08-29