Т. Маниатис Э. Фрич Дж. Сэмбрук 8 страница

ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК БАКТЕРИОФАГА X И ПЛАЗМИД 95»

Рис. 3.2. Отбор бактериофага с помощью прокалывания стенки пробирки.

Примечания. 1. Бактериофаг К чрезвычайно чувствителен к: ЭДТА, и для предотвращения его разрушения важно, чтобы на всех этапах очистки присутствовали ионы Mg²⁺ (в концентрации! 10—30 мМ).

2. Если выход очищенного фага оказывается низким, то еле- дует выяснить, на каком этапе происходят потери. Для этого' нужно определить число инфекционных частиц бактериофага в- пробах, отобранных на разных стадиях очистки.

Другие методы очистки бактериофага К

Описанный выше метод очистки бактериофага является, па< сути, методом, предложенным Ямамото и др. в 1970 г. (Yamamo­to et al., 1970). С годами в него было внесено много изменений, а некоторые стадии были исключены совсем. Ниже приводятся! три слегка модифицированные процедуры.

Осаждение частиц фага

1. Проведите очистку по Ямамото до стадий 8 включительно» (экстракция хлороформом) (с. 92—93).

2. Соберите частицы бактериофага центрифугированием при. 25000 об/мин в течение 2 ч при 4°С в роторе Beckman SW27“ (или аналогичном ему).

3. Слейте надосадочную жидкость. На дне пробирок должен» быть виден стекловидный осадок частиц бактериофага. В каж-

$6 ГЛАВА 3

дую пробирку добавьте по 1—2 мл среды SM и оставьте их на лочь при 4°С. Можно поместить пробирки на качающуюся плат­форму.

4. На следующее утро осторожно пипетируйте раствор, чтобы ресуспендировать все частицы бактериофага.

Хотя таким способом получаются не такие чистые препараты, как при равновесном центрифугировании в градиенте, их можно использовать как источник ДНК для получения плеч молекулы ДНК бактериофага X.

Приступайте к выделению ДНК со стадии 5 (с. 97).

Ступенчатый градиент глицерина¹

1. Проведите очистку по Ямамото до стадии 6 включительно (с. 92—93).

2. Ресуспендируйте осадок фага в буфере ТМ (50 мМ трис- НС1, pH 7,8, и 10 мМ MgS0₄), добавляя 5—10 мл буфера в рас­чете на 1 л исходной культуры.

3. Один раз проведите экстракцию суспензии бактериофага хлороформом.

4. Приготовьте ступенчатый градиент глицерина в прозрач­ных пробирках для ротора Beckman SW41 (или подобных ему):

а) на дно пробирки налейте пипеткой 3 мл буфера ТМ, со­держащего глицерин в концентрации 40%;

б) сверху осторожно наслоите 4 мл буфера ТМ, содержаще­го глицерин в концентрации 5%;

в) на раствор с глицерином осторожно наслоите суспензию

бактериофага;

т) заполните пробирку доверху буфером ТМ.,

5. Отцентрифугируйте препарат при 35000 об/мин и 4°С в течение 60 мин.

6. Слейте надосадочную жидкость и ресуспендируйте осадок 'бактериофага в буфере ТМ (1 мл в расчете на 1 л исходной культуры).

7. Добавьте панкреатическую ДНКазу и панкреатическую РНКазу до конечных концентраций 5 и 1 мкг/мл соответственно. Проинкубируйте 30 мин при 37 °С.

8. Добавьте ЭДТА (0,5 М, pH 8,0) до конечной концентра­ции 20 мМ.

9. Приступайте к выделению ДНК со стадии 5 (с. 97). Равновесное центрифугирование в хлористом цезии

Когда имеют дело с небольшими количествами препарата бактериофага (полученными из 1 л или менее), то центрифуги­рование в ступенчатом градиенте хлористого цезия можно опу­стить.

¹ Методика из работы Vande Woude et al., 1979, с модификациями.

ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК БАКТЕРИОФАГА к И ПЛАЗМИД 97

1. После экстракции хлороформом (стадия 8) измерьте

объем водной фазы и добавьте сухой хлористый цезий в расчете

0, 75 г на 1 мл. Осторожно перемешивайте до полного раство­рения. *

2. Когда хлористый цезий растворится, перенесите суспензию бактериофага в пробирку от ультрацентрифуги. Можно исполь­зовать пробирки как для углового ротора, так и для бакет-рото- ра. Заполните пробирку доверху буфером ТМ с хлористым це­зием (0,75 г/мл).

3. Проведите центрифугирование и соберите бактериофаг, как это описано на с. 94.

ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК БАКТЕРИОФАГА X

1. Удалите хлористый цезий из препарата очищенного бак­териофага посредством диализа при комнатной температуре в течение 1 ч против 1000-кратного объема буфера следующего состава: 10 мМ NaCl, 50 мМ трис-НС1, pH 8,0, 10 мМ MgCl₂.

2. Перенесите диализный мешок в сосуд со свежим буфером

и 1

и диализуите еще в течение I ч.

3. Перенесите суспензию бактериофага в центрифужную пробирку такого объема, чтобы она заполнилась лишь на треть.

4. Добавьте ЭДТА (0,5 М, pH 8,0) до конечной концентрации 20 мМ.

5. Добавьте проназу до конечной концентрации 0,5 мг/мл или же протеиназу К до конечной концентрации 50 мкг/мл.

6. Добавьте SDS (основной водный раствор, 20% по объему) до конечной концентрации 0,5%. Перемешайте содержимое про­бирки, несколько раз перевернув ее.

7. Проинкубируйте препарат I ч при 37 °С (в случае прона- зы) или при 65°С (в случае протеиназы К).

8. Добавьте равный объем насыщенного буфером фенола (с. 388). Перемешайте содержимое пробирки, несколько раз перевернув ее. Разделите фазы путем центрифугирования при 1600 g в течение 5 мин при комнатной температуре. Перенесите водную фазу в чистую пробирку, пользуясь пипеткой с широким носиком.

9. Один раз экстрагируйте водную фазу смесью насыщенного буфером феносла и хлороформа (50:50).

10. Соберите водную фазу, как это описано выше, и экстра­гируйте ее один раз равным объемом хлороформа.

11. Перенесите водную фазу в диализный мешок.

12. Проведите диализ в течение ночи при 4°С последователь­но против трех 1000-кратных объемов буфера ТЕ (10 мМ трис-НС], pH 8,0, и 1 мМ ЭДТА).

7—164

98 ГЛАВА 3

ч

ВЫДЕЛЕНИЕ БОЛЬШИХ КОЛИЧЕСТВ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК

Для выделения плазмидной ДНК пользуются многими мето­дами. Все они включают три основных этапа: рост бактерий и амплификацию плазмиды; сбор бактерий и их лизис; очистку плазмидной ДНК.

В этих методах очистки так и!ли иначе используют два ос­новных различия между“~ДНК...................... Escherichia coli и плазмидной

ДНК: 1) хромосома Е. co/t"по размеру много больше ДЙК" плаз­мид. обычно используемых в качестве векторов; 2) основная масса ДНК Е. colt выделяется из клеток в^ вице фрагментиро­ванных линейных молекул, тогда как большинство "гглаз^шдной

ДНК экстрагируется в...... виде ковалентно замкнутых кольцевых

молекул.. ^

Поэтому большинство методов очистки включают осаждения, при которых из препарата удаляются преимущественно^дл^шньгё^

coli, случайно захваченные обломками лизирован- ных клеток. Методики эти основаны также на использовании свойств кольцевой замкнутой ДНК. Каждая из комплементар­ных цепей плазмидной ДНК представляет собой ковалентно замкнутое,.кольцо, поэтому цепи нельзя отделить друг от друга (не разорвав'одну из них) в тех условиях, при которых происхо­дит разрыв большинства водородных связей в ДНК, например при нагревании или при выдерживании в умеренно щелочных растворах (дсРрН 12,5). При охлаждении или возвращении к нейтральному ]!№*гаэдгнутые кольцевые молекулы вновь прини­мают нативную конформацию, тогда как ДНК Е. coli остается денатурированной.

Плазмидная ДНК ведет себя отлично от ДНК Е. coli также и при равновесном центрифугировании в градиентах хлористого цезия, содержащих какой-нибудь интёркалирующий краситель в насыщающей концентрации, например бромистый этидий или дийодистый пропидий. Ковалентно замкнутые кольцевые ДНК связывают меньше такого красителя, чем линейная ДНК, и по­тому в градиентах хлористого цезия, содержащих интеркали- рующий агент, оказываются в адаах с 6п.т)рр_выгокпй_плотностью (Radloff et al., 1967). Эту методику используют, если необходи­ма высока^ степень^очисткн Плазмидной ДНК. Однако по мере развития методов работьГсГрекомбинантными ДНК для многих целей оказалось уже необязательным проводить очистку боль­ших количеств плазмидной ДНК до такой степени, чтобы пре­парат был гомогенным. Например, расщепление рестриктирую- щими эндонуклеазами, лигирование, трансформация и даже секвенирование ДНК можно.проводить теперь, используя отно­сительно малоочищенные препараты плазмидной ДНК, получен­ные из небольших объемов культуры (около 10 мл). Плазмид- ную ДНК выделяют из больших объемов культуры лишь в тех случаях, когда нужны значительные ее количества (например,

ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК БАКТЕРИОФАГА К И ПЛАЗМИД 99

в опытах по гибридизации для отбора специфических мРНК или когда нужно пометить 5'-концы фрагментов ДНК с помощью лолинуклеотидкиназы).

Описанные ниже методики можно успешно использовать для выделения разнообразных плазмид из различных штаммов бак­терий. Вообще говоря, чем меньше,,цлазмида^.1£м_ь.лучше дости­гаемые результаты. С увеличением^длекуляраои массы плазми­ды ее свойства становятся*"все ближе к свойствам ДНК хозяи­на. Выделение плазмид, размер которых превышает 25 kb, силь­но затрудняется и выход оказывается невысоким. Однако все илазмиды, обычно используемые при клонировании, относитель­но невелики и приведенные ниже методы дают хорошие резуль- - та ты,

РОСТ БАКТЕРИЙ И АМПЛИФИКАЦИЯ ПЛАЗМИДЫ

Амплификация в богатой среде

В течение многих лет считали, что амплификация плазмид в присутствии хлорамфеникола происходит эффективно лишь при выращивании бактерии-хозяина в синтетической среде. Однако приводимая ниже процедура дает воспроизводимо высокие выхо­ды (>2 мг плазмиды на 1 л культуры) при использовании штам­мов Е. coli, содержащих плазмиды с решшконом ColEl.

1. Засейте 10 мл среды LB, содержащей соответствующий антибиотик, отдельной колонией бактерии. Проинкубируйте в течение ночи лри температуре 37°С при интенсивном встряхи­вании.

2. На следующее утро посейте 0,1 мл ночной культуры в 25 мл среды LB с соответствующим антибиотиком в колбе на 100 мл. Проинкубируйте при 37 °С при интенсивном встряхива­нии до тех пор, пока культура не достигнет поздней логарифми­ческой фазы.(£бао = 0,6).

3. Внесите 25 мл культуры в поздней логарифмической фазе в 500 мл среды LB с соответствующим антибиотиком, предва­рительно прогретой до 37 °С в колбе на 2 л. Проинкубируйте ровно 2,5 ч при 37 °С при энергичном встряхивании. D₆оо куль­туры должна составить примерно 0,4.

4. Добавьте 2,5 мл раствора ^зу^а^микрла (34 мг/мл в этаноле). Конечная концентрация хлорамфеникола в культуре должна быть 170 мкг/мл.

5. Проинкубируйте при 37 °С при интенсивном встряхивании

еще 12—16 ч..

Амплификация в минимальной среде

Хотя в настоящее время эта процедура (Clewell, Helinski, 1972) в значительной степени вытеснена той, которая была при­ведена выше, ее все еще можно использовать в случае релакси- рованных плазмид с репликонами, отличными от ColEl.

7*

100. ГЛАВА 3.

1. Отобрав отдельную колонию, выросшую в присутствии соответствующего антибиотика, засейте ею 10 мш богатой среды (например, LB) с этим антибиотиком. Инкубируйте в течение ночи.

2. Посейте 2,5 мл ночной культуры в колбу объемом 2 л, со­держащую 500 мл минимальной среды (М9) с соответствующим антибиотиком. Проинкубируйте при 37 °С при интенсивном встряхивании до тех пор, пока Азоо культуры не достигнет 0,4—

0, 5. Очень важно, чтобы концентрация клеток не была выше, так как при этом снизится эффективность амплификации.

3. Добавьте раствора хлорамфеникола (34 мг/мл в

этаноле). Продолжайте инкубацию еще в течение 12—16 ч.

СБОР БАКТЕРИЙ И ЛИЗИС

Сбор бактерий

1. Соберите бактериальные клетки центрифугированием при 4000 g в течение 10 мин при 4°С. Слейте надосадочную жид­кость.

2. Промойте клетки 100 мл охлажденного во льду буфера STE (0,1 М NaCl, 10 мМ трис-НС1, pH 7,8, 1 мМ ЭДТА).

Лизис

Ниже приведены три различные методики лизиса. Первые две, лизис кипячением и лизис щелочью, отличаются высокой эффективностью и в случае малых плазмид (<10 kb) дают вы­ход 2—3 мг/л. Третий метод сравнительно более мягкий, и им следует пользоваться в случае больших плазмид (>10 kb).

Лизис кипячением¹

1. Ресуспендируйте осадок бактерий, полученный из куль­туры объемом 500 мл, в 10 мл буфера STE (0,1 М NaCl, 10 мМ трис-НС1, pH 8,0, 0,1 мМ ЭДТА). Перенесите смесь в колбу Эршенмейера на 50 мл.

2. Добавьте 1 мл свежеприготовленного раствора лизоцима (20 мг/мл в 10 мМ трис-НС1, pH 8,0).

Примечание. Лизоцим не будет работать эффективно, если pH раствора ниже 8,0. -

3. Пользуясь зажимом, подержите колбу Эрленмейера над открытым огнем бунзеновской горелки до тех пор, пока жид­кость в ней не начнет кипеть. Колбу все время встряхивайте.

¹ Holmes, Quigley, 1981.

ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК БАКТЕРИОФАГА к И ПЛАЗМИД - 101

4. Сразу же перенесите колбу в большую баню (объемом

2 л) с кипящей водой. Держите колбу в кипящей воде в течение 40 с.

5. Охладите колбу, поместив ее на 5 мин в ледяную баню.

6. Перенесите вязкое содержимое колбы в центрифужную пробирку (от ротора Beckman SW41 или аналогичного ему). Отцентрифугируйте при 25 000 об/мин в течение 30 мин при 4°С.

7. Очистите плазмидную ДНК равновесным центрифугирова­нием в градиенте хлористого цезия с бромистым этидием (с. 103).

Лизис щелочью¹

1. Ресуспендируйте полученный из 500 мл культуры осадок бактерий в 10 мл раствора I, содержащего лизоцим в концентра­ции 5 мг/мл.

Раствор I. 50 мМ глюкоза, 25 мМ трис-НС1, pH 8,0, 10 мМ ЭДТА.

Раствор I можно приготовить порциями примерно по 100 мл, проавтоклавировать в течение 15 мин при давлении 7-10⁴ Па и хранить при 4°С. Сухой лизоцим следует растворять в нем не­посредственно перед использованием.

2. Перенесите суспензию в полиалломерные пробирки от ро­тора Beckman SW27 (или аналогичного ему). Оставьте на 5 мин при комнатной температуре.

3. Добавьте 20 мл свежеприготовленного раствора II. За­кройте пробирку сверху парафильмом и перемешайте содержи­мое, несколько раз осторожно перевернув пробирку. Поставьте на 10 мин в лед.

Раствор II. 0,2 н. NaOH, 1% SDS.

Раствор II следует готовить из исходных растворов 10 н.

NaOH и 20% SDS.

4. Добавьте 15 мл охлажденного во льду 5 М ацетата калия, pH 4,8, приготовленного следующим образом: к 60 мл 5 М аце­тата калия добавьте 11,5 мл ледяной уксусной кислоты и 28,5 мл Н₂0. Получающийся раствор является 3 М по ка'лию и 5 М по ацетату. Закройте пробирку сверху парафильмом и перемешайте содержимое, несколько раз резко перевернув пробирку. Оставьте во льду на 10 мин.

5. Отцентрифугируйте в роторе Beckman SW27 (или анало­гичном ему) при 20 000 об/мин в течение 20 мин при 4°С. Бак­териальная ДНК и обломки клеток должны образовать на дне пробирки плотный осадок.

6. Перенесите по равному объему (~18 мл) надосадочной жидкости в две пробирки Согех объемом по 30 мл.

¹ Эта процедура описана Бирнбоймом и Доли (Birnboim, Doly, 1979) и модифицирована Иш-Горовицем (личное сообщение).

102 ГЛАВА 3

■ ^J7. Добавьте в каждую пробирку 0,6 объема (~12 мл) изо­пропанола. Хорошо перемешайте и оставьте на 15 мин при ком­натной температуре.

8. Осадите ДНК центрифугированием в роторе Sorvall при 12 ООО g в течение 30 мин при комнатной температуре.

Примечание. Если центрифугирование проводить при 4°С, то может выпасть в осадок соль.

9. Слейте надосадочную жидкость. Промойте осадок 70%-ным этанолом при комнатной температуре. Слейте как можно боль­ше этанола, затем высушите осадок нуклеиновой кислоты, поместив пробирки на короткое время в вакуумный испаритель.

10. Растворите осадки в буфере ТЕ, pH 8,0, чтобы суммар­ный объем смеси составлял 8 мл.

11. Очистите плазмидную ДНК, проведя равновесное центри­фугирование в градиенте плотности хлористого цезия с броми­стым этидием (с. 103).

Примечание. Как ни удивительно, этот метод дает хорошие результаты также и в случае плазмид, которые были амплифи- цированы в присутствии хлорамфеникола. При длительной об­работке клеток этим лекарственным препаратом образуются плазмиды, ДНК которых частично замещена рибонуклеотидны- ми последовательностями. Так как эти небольшие последова­тельности должны расщепляться щелочью, можно ожидать, что при использовании этой методики получатся препараты, в кото­рых необычно много кольцевых молекул с одноцепочечными раз­рывами. Однако в наших препаратах ДНК разрывы содержа­лись менее чем в 5% молекул.

Лизис под действием SDS¹

1. Ресуспендируйте осадок бактерий в 10 мл охлажденного во льду буфера следующего состава; 10%-ная сахароза, 50 мМ трис-HCl, pH 8,0. Перенесите суспензию в пробирку Oak Ridge на 30 мл.

2. Добавьте 2 мл свежеприготовленного раствора лизоцима (10 мг/мл в 0,25 М трис-НС1, pH 8,0).

3. Добавьте 8 мл 0,25 М ЭДТА. Перемешайте, несколько раз перевернув пробирку. Поместите в лед при 0°С на 10 мин.

4. Добавьте 4 мл 10%-ного SDS. Быстро перемешайте стек­лянной палочкой, чтобы SDS равномерно распределился по су­спензии бактерий, но в то же время достаточно осторожно, чтобы не повредить освобождающуюся бактериальную ДНК-

5. Сразу же добавьте 6,0 мл -5 М NaCl (конечная концентра­ция 1 М). Вновь осторожно, но тщательно перемешайте. Помес­тите в лед по крайней мере на 1 ч.

¹ Godson, Vapnek, 1973.

ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК БАКТЕРИОФАГА X И ПЛАЗМИД ЮЗ

6. Чтобы удалить высокомолекулярную ДНК и обломки бак­терий, отцентрифугируйте в течение 30 мин при 30 000 об/мин при 4°С в роторе Beckman БОТi (или аналогичном ему).

7. Слейте и сохраните надосадочную жидкость. Осадок, кото­рый должен быть твердым и плотным, выбросьте.

8. Проведите две экстракции надосадочной жидкости смесью фенол/хлороформ и одну экстракцию хлороформом. После каж­дой экстракции переносите водную фазу в чистую пробирку.

9. Перенесите водную фазу в стеклянный центрифужный ста­кан на 250 мл. Добавьте 2 объема (~60 мл) этанола. Хорошо перемешайте. Оставьте на 1—2 ч при —20°С или на 15 мин при —70 °С.

10. Осадите нуклеиновые кислоты центрифугированием при 1500 g в течение 15 мин при 4 °С.

11. Вылейте надосадочную жидкость. Промойте осадок 70%-ным этанолом при комнатной температуре. Слейте как можно больше этанола. Высушите осадок, поместив стаканы на короткое время в вакуумный испаритель.

12. Растворите ДНК в буфере ТЕ, pH 8,0, чтобы суммарный объем смеси был равен 8 мл.

13. Очистите плазмидную ДНК с помощью равновесного центрифугирования в градиенте хлористого цезия с бромистым этидием.

ОЧИСТКА КОВАЛЕНТНО ЗАМКНУТОЙ КОЛЬЦЕВОЙ

ДНК РАВНОВЕСНЫМ ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕМ В ГРАДИЕНТЕ

ХЛОРИСТОГО ЦЕЗИЯ С БРОМИСТЫМ ЭТИДИЕМ

1. Измерьте объем раствора ДНК. На каждый миллилитр добавьте точно 1 г сухого хлористого цезия. Осторожно переме­шивайте до тех пор, пока соль не растворится.

2. На каждые 10 мл раствора с хлористым цезием добавьте

0, 8 мл раствора бромистого этидия (10 мг/мл в Н₂0). Конечная плотность раствора должна составить 1,55 г/мл (i)^ 1,3860), а концентрация бромистого этидия должна быть примерно 600 мкг/мл.

Примечание. Всплывающие на поверхность раствора пушис­тые пурпурные хлопья представляют собой комплексы бромисто­го этидия с бактериальными белками.

3. Перенесите раствор хлористого цезия (вместе с белковыми хлопьями) в центрифужные пробирки от ротора Beckman 50 или 65. Заполните пробирки доверху вазелиновым маслом.

4. Отцентрифугируйте при 45 000 об/мин в течение 36 ч при

5. При обычном освещении должны быть видны две полосы ДНК. Верхняя полоса — это линейная бактериальная ДНК и кольцевая плазмидная ДНК с одноцепочечными разрывами.

104 ГЛАВА \

Масло

Белок

Открытая кольцевая и линейная ДНК

Замкнутая кольцевая ллазмидная ДНК

Осадок РНК

**' * Г * 1 "д / I! i' ^.7

£?■■■.■ ■■■■■■■■■■•'"У-.-.'--.'-.-:

• * * * • ■ *»* *•» * * ₄*

г /;■ \ '

У:

:V;-4*A s Л*.: {

■■ /:’■*»'* ■ 1 /.

.^ц - *,

Рис. 3.3.

Нижняя полоса — кольцевая ковалентно замкнутая плазмидная ДНК (рис. 3.3).

6. Снимите с пробирки крышку. Соберите материал нижней полосы ДНК в стеклянную пробирку с помощью иглы № 21 для подкожных инъекций, проколов ею сбоку стенку пробирки, как это описано на е. 94.

7. Удалите бромистый этидий следующим образом:

а) добавьте равный объем 1-бутанола, насыщенного во­дой, или изоамилового спирта;

б) энергичным пипетированием смешайте обе фазы;

в) отцентрифугируйте при 1500 g в течение 3 мин при ком­натной температуре;

г) перенесите нижнюю водную фазу в чистую стеклянную пробирку;

д) повторите экстракцию 4—6 раз, пока не исчезнет розо­вая окраска у водной фазы.

8. Проведите диализ водной фазы против нескольких смен буфера ТЕ (pH 8,0).

УДАЛЕНИЕ РНК ИЗ ПРЕПАРАТОВ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК

Для некоторых целей (например, для расщепления рестрик- тазой Ва131 или для мечения б'-концов рестрикционных фраг­ментов плазмидной ДНК с помощью полинуклеотидкиназы) не­обходимы препараты ДНК, не содержащие примеси низкомоле­кулярной РНК. Хотя по массе такая примесь составляет неболь­шую часть препарата плазмидной ДНК, полученного с помощью

ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК БАКТЕРИОФАГА к И ПЛАЗМИД 105

равновесного центрифугирования в градиенте хлористого цезия с бромистым этидием, число молекул низкомолекулярной РНК может быть относительно велико и 5'-концы этих молекул могут составлять значительную часть всех 5'-концов, образующихся после обработки препарата рестриктирующей эндонуклеазой.

РНК удаляют из препаратов плазмиды любым из следующих способов.

Центрифугирование в 1 М NaCl¹

1. Измерьте объем раствора ДНК. Добавьте 0,1 объема 3 М ацетата натрия, pH 5,2, а затем 2 объема этанола. Хорошо пере­мешайте и поместите на холод (—20°С).

2. Соберите ДНК центрифугированием. Слейте этанол и вы­сушите осадок ДНК, поместив пробирки на короткое время в вакуумный испаритель.

3. Растворите ДНК в буфере ТЕ, pH 8,0, в концентрации не ниже 100 мкг/мл.

4. Добавьте РНКазу, свободную от ДНКазы (с. 397), до ко­нечной концентрации 10 мкг/мл. Проинкубируйте при комнатной температуре в течение 1 ч.

5. В центрифужную пробирку от ротора Beckman SW50.1 (или аналогичного ему) налейте 4 мл раствора 1 М NaCl+TE. Поверх раствора 1 М NaCl наслоите 1 мл обработанной РНКазой плазмидной ДНК. Если останется место, заполните пробирку доверху буфером ТЕ. Отцентрифугируйте 6 ч при 40 000 об/мин при 20 °С в роторе Beckman SW50.1. Плазмидная ДНК осядет на дно пробирки, в то время как рибонуклеотиды останутся в надосадочной жидкости,

6. Слейте надосадочную жидкость. Растворите осадок плаз­мидной ДНК в желаемом объеме ТЕ.

Хроматография на биогеле А-150²

1. Обработайте препарат плазмидной ДНК РНКазой, как это описано выше (этапы 1—4).

2. Проведите одну экстракцию равным объемом уравнове­шенного буфером фенола.

3. Наслоите 1 мл водной фазы на колонку с биогелем А-150 (1 смХЮ см), уравновешенным буфером ТЕ, pH 8,0, с 0>1%-ным SDS.

4. Нанесите ДНК на колонку; подсоедините к колонке ре­зервуар с ТЕ + 0,1°/о-ный SDS и сразу же начинайте собирать фракции объемом по 0,5 мл.

¹ В. Seed, неопубликованные данные.

² Модификация процедуры, разработанной ДеНото и Гудмэном (F. De Noto, Н. Goodman, неопубликованные данные).

106 ГЛАВА 3

5. После сбора 15 фракций перекройте выход из колонки. Чтобы определить, в каких фракциях содержится плазмидная ДНК, проанализируйте по 10 мкл каждой фракции с помощью электрофореза в 0,7%-ном агарозном геле или по флуоресцен­ции бромистого этидия (см. Приложение А).

6. Слейте вместе те фракции, которые содержат плазмидную ДНК. Осадите ДНК этанолом, как это было сделано на этапах 1—3,

Примечание. Удалить из колонки с биогелем А-150 всю плаз­мидную ДНК очень трудно. Чтобы исключить возможность за­грязнения, используйте колонку лишь один раз.

ФЕРМЕНТЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В МОЛЕКУЛЯРНОМ КЛОНИРОВАНИИ

ФЕРМЕНТЫ РЕСТРИКЦИИ

Рестриктирующие эндонуклеазы (или рестриктазы) — это ферменты, «узнающие» определенные последовательно­сти (сайты рестрикции) в двухцепочечной ДНК и расщеп­ляющие молекулу ДНК в этих сайтах. Их выделяют пре­имущественно из прокариотических клеток. Рестриктазы можно разделить на три группы. Ферменты типа I и ти­па III обладают модифицирующей (метилирующей) актив­ностью и ATP-зависимой рестриктирующей активностью (внесение разрывов), проявляемыми одним и тем же бел­ком. Ферменты обоих типов узнают неметилированные по­следовательности в ДНК-субстрате, но ферменты типа I вносят случайные разрывы, в то время как ферменты ти­па III разрезают ДНК в специфических участках.

Системы рестрикции — модификации типа II включают два отдельных фермента; рестриктирующую эндонуклеазу и модифицирующую метилазу. Бы1ло выделено большое число ферментов рестрикции типа II (Roberts, 1982), многие из которых используются в молекулярном клонировании. Эти ферменты разрезают ДНК внутри или около своих сайтов, которые обычно имеют 4—6 нуклеотидов и облада­ют осью симметрии 2-го порядка. Например, фермент £coRI узнает последовательность гексануклеотидов

5' з*

G-Д.Д-Т-Т-С

„С-T-T-A-A-G.

3' 5

Подобно многим другим ферментам рестрикции, £coRI вносит разрыв не точно по оси симметрии 2-го порядка, а в точках двух цепей ДНК, отстоящих друг от друга на че­тыре нуклеотида:

108 ГЛАВА 4

В результате такого разрыва образуются фрагменты ДНК с выступающими липкими 5'-концами. Каждый такой конец может взаимодействовать с любым другим концом, комплементарным ему. Таким образом любые молекулы ДНК, содержащие сайты рестрикции, можно соединять с другими молекулами и в результате получать рекомби­нантные молекулы.

Многие ферменты рестрикции, подобно £coRI, катали­зируют разрывы, в результате которых образуются фраг­менты ДНК с выступающими 5'-концами; под действием других (например, PstI)—с выступающими З'-липкими концами, в то время как третьи (например, Ball) разреза­ют ДНК по оси симметрии с образованием фрагментов с тупыми концами.

ИЗОШИЗОМЕРЫ

Обычно разные ферменты рестрикции узнают разные после­довательности (табл. 4.1). Однако имеется несколько примеров выделенных из разных источников ферментов, вносящих разры­вы в одинаковые последовательности-мишени. Такие ферменты называют изошизомерами. Кроме того, было обнаружено, что некоторые ферменты узнают тетрануклеотидные последователь­ности. Иногда такие тетрануклеотиды находятся внутри гекса- нуклеотидных последовательностей-мишеней для других фермен­тов. Например, рестриктазы MboI и Sau3A узнают последова­тельность

. 5'(3'

,..G-A-T-C...

...C-T-A-G.

3' | 5

1 -

в то время как рестриктаза BamHI узнает последовательность

г • '

5* I V

T..G G-A-T-C-C.7.

Из предположения, что участки узнавания рестриктирующих эндонуклеаз распределены вдоль цепи ДНК случайно, следует, что тетрануклеотидная мишень для МЬо\ и SatiSA должна встре­чаться в среднем один раз на каждые 4⁴ (т. е. 256) нуклеоти­дов, тогда как^хгексаиуклеотидная мишень для BamHI должна встречаться один раз на 4^б (т. е. 4096) нуклеотидов. Фрагменты ДНК, полученные при полном или частичном расщеплении эука­риотической ДНК ресТриктазами MboI и Sau3A, можно, сле­довательно, клонировать или субклонировать в составе вектор-

ФЕРМЕНТЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В МОЛЕКУЛЯРНОМ КЛОНИРОВАНИИ 1^9

ной ДНК (такой, как ДНК бактериофага Я или pBR322), обра­ботанной BamHI. Следует иметь в виду, что в большинстве слу­чаев соединение МЬо\- и BamHI-фрагментов не приводит к вос­становлению сайта для BamHI. Поэтому расщеплением реком­бинантной молекулы рестриктазой BamHI обычно не удается выделить Л4&о1-фрагмент, встроенный в BamHI-вектор.

В некоторых случаях в результате сшивания фрагментов, по­лученных с помощью двух разных рестриктаз, образуются гиб­риды, не содержащие сайтов рестрикции ни для одного из этих ферментов. К примеру, при сшивании фрагментов, полученных с помощью рестриктаз Sa/I(G|TCGAC) и Xhol (CjTCGAC), об­разующийся гибрид не расщепляется ни Sail, ни Xhol:

5*

...6

...C-A-G-C-T

T-C-G-A-G... С...

3*

5'

⁵...G-T-C-G-A-G...C-A-G-C-T-C...

3‘

МЕТИЛИРОВАНИЕ

Большинство штаммов E. coli содержит два фермента, мети­лирующих ДНК: метилазу dam и метилазу dcm. '

Метилаза dam. Этот фермент метилирует атом N⁶ аденина в последовательности ⁵'GATC³' (Hattman et al., 1978). Такая по­следовательность входит в состав сайтов рестрикции для не­скольких рестриктаз (Pvul, BamHI, Bell, Bglll, Xholl, Mbol, Sau3A) и части сайтов рестрикции для Clal (1 сайт из 4), Xbal (1 сайт из 16), Taql (1 сайт из 16), Mboll (1 сайт из 16) и Hphl (1 сайт из 16). Влияние метилирования, осуществляемого dam-метилазой, на расщепление ДНК этими ферментами сумми­ровано в табл. 4.2.

Ингибирование метилазой dam расщепления прокариотиче­ской ДНК рестриктазой Mbol не приводит к практическим ос­ложнениям, поскольку Sau3A узнает ту же последовательность, что и MboI, но не зависит от метилирования, осуществляемого метилазой dam. (Следует иметь в виду, что эукариотическая ДНК не метилируется в положении N⁶ аденина, и поэтому MboI и Sau3A могут быть использованы с равным успехом.) Однако, когда необходимо расщепить прокариотическую ДНК по всем возможным сайтам рестриктазами Clal, Xbal, Taql, Mboll или Я/Ш или расщепить полностью рестриктазой Bell, ее необходи­мо получать из Лхт~-штаммов Е. coli (Marinus, 1973; Backman, 1980; Roberts et al., 1980; McClelland, 1981; J. Brooks, неопубли­кованные данные).

Таблица 4.1. Ферменты рестрикции

_Л Изошизо- Ионная Темпера-

Фермент мрпм l) ^тУР^а инку-

меры сила йации. °С

Accl	Средняя
Асу\
Alul
AosI
Apyl	Atul, EcoRII
Asul
Asull
Atull
Aval	»
Avail
Avrll	Низкая
Ball
BamHI	Средняя
Bbv I	Низкая
Beil	Средняя
Bgll
Bglll	Низкая
В pal
BstEII	Средняя

Дата добавления: 2015-08-29