Т. Маниатис Э. Фрич Дж. Сэмбрук 13 страница

20В ГЛАВА 7

с^т 5?^ag

p*ti

EcoRI Hind И

мРНК

pBR322

оц-кДНК..

с:

АЦ-кДНК

С С)п

т

Отжиг (реассоциация)

CTGCAG(G)nGG GACGTC(C)nCC •

4 Трансформация

-------- CC(C)nCTGCAG

GG(G)nGACGT С

кДНК

PBR322

f

Pst I

(G)n-

ACGT(C)n

■***

Обратная транскриптазы

t

Фрагмент Кленова ДНК-попимеразы f

!

Обратная транскриптаза

*

*

Нуклеаза S1

♦

Т ерминальная трансфераэа

(С)п

(C)nTGCA

tG)n

Выделенный фрагмент (кДНК)'

Рис. 7.1. Синтез второй цепи кДНК.

(Efstratiadis et al., 1976), широко используются и сейчас (Wic- kens et al., 1978). Коротко о методе: реакцию проводят при pH

6,9, чтобы свести к минимуму 5'—>-3'-экзонуклеазную активность ДНК-полимеразы I, и при 15 °С для уменьшения вероятности схлопывания синтезируемой ДНК. Для синтеза второй цели кДНК был также успешно использован фрагмент Кленова ДНК-

СИНТЕЗ И КЛОНИРОВАНИЕ кДНК 20£*

полимеразы I, у которого отсутствует б'-^З'-эзонуклеазная ак­тивность.

Многие исследователи для синтеза второй цепи кДНК ис­пользовали обратную транскриптазу в условиях, аналогичных ранее описанным для синтеза первой цепи кДНК. Несмотря н» одно сообщение о том, что обратную транскриптазу из вируса миелобластоза птиц (AMV) нельзя использовать для синтеза второй цепи иммуноглобулиновой кДНК (Rougeon, Mach, 1976), успешное проведение большого числа экспериментов по синтезу второй цепи с помощью обратной транскриптазы указывает на то, что это затруднение не носит общего характера. Мы рекомен­дуем использовать оба фермента последовательно. Смысл этого* метода, предложенного Эфстратиадисом, заключается в том, что ДНК-полимераза I и обратная транскриптаза могут задержи­ваться или останавливаться на различных последовательностях. Таким образом, вторые цепи, частично синтезированные одними ферментом, могут быть завершены другим.

РАСЩЕПЛЕНИЕ ПЕТЛИ ШПИЛЬКИ НУКЛЕАЗОИ S1

По окончании синтеза кДНК первая и вторая цепи остаются ковалентно связанными петлей шпильки, служившей затравкой при синтезе второй цепи (Efctratiadis et al., 1976). Эта петля мо­жет быть расщеплена нуклеазой S1, специфически разрушаю­щей одноцепочечные участки нуклеиновых кислот. Образующие­ся при этом концы не всегда оказываются полностью тупыми, и для повышения эффективности клонирования их достраивают с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I Е. coli (Se- eburg et al., 1977). Затем либо двухцепочечную ДНК фракцио­нируют по размеру и самые крупные молекулы встраивают бактериальные плазмиды, либо клонируют весь спектр молекул двухцепочечных ДНК для создания библиотеки кДНК.

МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ ДВУХЦЕПОЧЕЧНОЙ к ДНК

Существует множество методов связывания двухцепочечной' кДНК с плазмидными векторами (Efstratiadis, Villa-Komaroff^ 1979; Maniatis 1980; Williams, 1981). К наиболее распространен­ным относятся следующие методы:

1. Добавление к двухцепочечной кДНК и к плазмидной ДНК комплементарных гомополимерных последовательностей. За счет образования водородных связей между комплементарными го- мополимерными «хвостами» вектор и двухцепочечная кДНК со­единяются, образуя открытые кольцевые гибридные молекулы, способные трансформировать клетки Е. coli. Для стабилизации: рекомбинантных плазмид в клетках Е. coli формирование замк-

14—164

310 ГЛАВА 7

аутой кольцевой ДНК с помощью ферментативного сшивания не обязательно.

2. Присоединение синтетических связывающих участков (лин­керов) к концам, двухцепочечной кДНК. После расщепления под-.ходящей рестриктазой молекулы кДНК встраивают в плазмид- лую ДНК, также расщепленную соответствующим ферментом.

ПРИСОЕДИНЕНИЕ ГОМОПОЛИМЕРНЫХ КОНЦЕВЫХ

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Присоединение концевых последовательностей dA*dT

Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза из тимуса те­ленка, катализирующая присоединение дезоксинуклеотидов к З'-ОН-концам одно- и двухцепочечных ДНК, впервые была ис­пользована Венсинком и др. (Wensink et al., 1974) для встраи­вания рекомбинантной ДНК в клетки Е. coli методом присоеди­нения dA-dT(Jackson et al., 1972; Lobban, Kaiser, 1973). В ори­гинальной методике с 5'-концов двухцепочечной ДНК удаляли небольшое количество нуклеотидов, так чтобы оставались высту­пающими одноцепочечные З'-ОН-концы, которые служили эф­фективными матрицами для терминальной трансферазы. Необ­ходимость в этом этапе отпала, когда было показано, что в присутствии ионов кобальта терминальная трансфераза может использовать и не выступающие З'-концы (Roychoudhury et al.,

1976). Обычно присоединяют от 50 до 150 остатков dA к линей­ной векторной ДНК и соответствующее количество остатков dT к двухцепочечной кДНК.

Двухцепочечная кДНК, встроенная в плазмиды с помощью присоединения dA-dT, может быть вырезана из плазмиды и воз­вращена в исходное состояние одним из трех способов. Первый способ включает расщепление рекомбинантной плазмидной ДНК нуклеазой S1 в мягких денатурирующих условиях, когда в основном происходит плавление dA-dT-линкеров (Hofstetter >et al., 1976). Этот эффект достигается за счет включения форма- мида (20—50%) в буфер для «уклеазы S1 и проведения рас­щепления три повышенной температуре (37—55 °С). Эффектив­ность реакции зависит от длины участков dA-dT: встроенные ДНК с короткими линкерами трудно вырезать. Оптимальные ус­ловия (включая концентрации ДНК и фермента) следует уста­навливать эмпирически для каждого йлона кДНК. В некоторых случаях более высокий выход встроенной ДНК и меньшее ко­личество побочных продуктов расщепления удается получить при использовании вместо нуклеазы S1 нуклеазы из золотистой фа­соли (Phaseolus aureus), специфически расщепляющей одно- ■цепочечные участки нуклеиновых кислот (Green, неопубликован­ные данные). Это может быть обусловлено относительно высо-

СИНТЕЗ И КЛОНИРОВАНИЕ кДНК 21Ь

кой специфичностью нуклеазы из золотистой фасоли по отно­шению к АТ-богатым двухцепочечным ДНК (Johnson, Laskows- ki, 1970).

Другой метод, редко используемый, включает превращение плазмидной ДНК в линейные двухцепочечные молекулы при использовании фермента рестрикции, не вносящего разрывов - во встроенную ДНК (Goff, Berg, 1978). Линейную ДНК затем денатурируют и быстро ренатурируют, позволяя схлопнуться. остаткам dA и dT, находящимся по обе стороны встроенной; кДНК. После этого векторную ДНК удаляют обработкой эк­зонуклеазой VII Е. coli, расщепляющей одноцепочечную ДНК. и в 5'->-3'-, и в З'-^б'-направлениях. Дуплексы dA-dT затем плавят, а две цепи встроенной ДНК подвергают отжигу с об­разованием двухцепочечной ДНК.

Еще один подход — встраивание двухцепочечной ДНК в участок плазмиды, непосредственно окруженный двумя гекса- нуклеотидными сайтами рестрикции; например, в плазмиде pBR 322 сайты рестрикции для ферментов EcoRI, Clal и Hind

III находятся внутри области размером 30 нуклеотидных пар. Таким образом, двухцепочечная кДНК, встроенная в сайт ре­стрикции Clal методом концевого присоединения dA-dT, мо­жет быть вырезна рестриктазами £coRI и tfmdlll.

В принципе целостность сайтов рестрикции для tfmdlll мо­жет быть восстановлена путем расщепления плазмидной ДНК рестриктазой tfmdlll, концевого присоединения oligo (dT) и от-" жига с двухцепочечной кДНК, имеющей dA-концы. После это­го встроенную кДНК можно удалить из плазмиды с помощью обработки Hindlll, По неизвестным причинам этим методом пользовались только в редких случаях.

Присоединение концевых последовательностей dC-dG

В настоящее время наиболее широко применяемый метод клонирования кДНК с использованием концевого присоедине­ния гомополимерных последовательностей включает добавле­ние концов dG к плазмиде и комплементарных концов dC к KflHK(Villa-Komaroff et al., 1978; Rowekamp, Firtel, 1980).

С помощью этого метода получают клоны, из которых легко мо­жет быть удалена встроенная ДНК. Такие плазмиды, как pBR* 322 или рАТ153_т расщепляются ферментом PstI, который вносит- разрывы в последовательность

⁵'С—Т—G—С—A—G³'

_3, G—А—С—G—Т—С₅/

оставляя выступающие З'-концы. Добавление к линейной плаз­мидной ДНК короткой последовательности из остатков dG при­водит к восстановлению сайта рестрикции для PstI на каждом;

и*

212 ГЛАВА 7

конце встроенной ДНК, которая, следовательно, может быть удалена из плазмиды обработкой Pstl (рис. 7.1). На практике эффективность восстановления целостности сайта рестрикции для Pstl зависит от качества рестриктазы Pstl, использованной для превращения ДНК плазмиды pBR322 в линейную форму, и от качества терминальной трансферазы. Если с выступающего З'-конца оледовыми количествами экзонуклеазы удаляется пред­последний остаток, последующее добавление остатков dG не приведет к восстановлению последовательности узнавания для Pstl. Тем не менее при соблюдении необходимой осторожности до 80—90% рекомбинантных плазмид, сконструированных этим методом, содержат встроенные фрагменты, окруженные сайтами рестрикции для Pstl.

Недавно было определено число остатков dA-dT и dG-dC, необходимое для наиболее эффективной трансформации ДНК (Peacock et al., 1981). Как правило, число остатков, приходя­щееся на плазмиду, должно примерно совпадать с числом остат­ков, приходящимся на кДНК, составляя ~ 100 добавленных ос­татков на каждую молекулу ДНК в случае присоединения dA* *dT и около 20 остатков в случае присоединения dG-dC (Pea­cock et al., 1981). Интересно, что бактериальные штаммы значи­тельно различаются по эффективности трансформации. Штамм RR1 (гесЛ+-штамм Е. coli) дает в 10 раз больше рекомбинант­ных клонов с кДНК, полученных методом концевого присоеди­нения dA*dT, чем гесА~-штамм НВ101. В том же эксперименте интактная ДНК плазмиды pBR322 трансформировала оба штам­па с одинаковой эффективностью (Peacock et al., 1981). Таким ■образом, можно предположить, что бактериальная система гесА участвует в репарации открытых кольцевых гибридных молекул ДНК, содержащих на концах гомополимерные последователь­ности.

СИНТЕТИЧЕСКИЕ ЛИНКЕРЫ

Другой метод присоединения двухцепочечной кДНК к плаз- тмидным векторам основан на 'использовании синтетических лин­керов, содержащих один или несколько сайтов рестрикции. Двухцепочечную кДНК, полученную, как описано ранее, обра­батывают ДНК-полимеразой бактериофага Т4 или ДНК-полиме- разой I Е. coli — ферментами, расщепляющими выступающие од­ноцепочечные З'-концы благодаря своей 3'-^5'-экзонуклеазной активности и достраивающими укороченные таким образом 3'- концы благодаря полимеразной активности. Сочетание этих ак­тивностей приводит к образованию молекул кДНК с тупыми концами, которые далее инкубируют с большим избытком лин- тсерных молекул в присутствии ДНК-лигазы бактериофага Т4— «фермента, способного катализировать сшивание молекул ДНК

СИНТЕЗ И КЛОНИРОВАНИЕ кДНК 213

Двухцепоче^ная кДНК

f

Репарация с помощью обработки фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I Е. coli

♦

Присоединение первого линкера

ШШ

♦

Обработка нуклеазой S1

ТГПТ

Репарация с помощью обработки фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I Е. Coli

шш

Присоединение второго линкера

<с тупыми концами. В ре-
зультате этой реакции
образуются молекулы
кДНК, несущие на кон-
цах полимерные линкер-
ные последовательности.

Затем эти молекулы раз-
резают определенным
ферментом рестрикции и
пришивают к плазмидно-
му вектору, в который
также был внесен разрыв
соответствующим фер-
ментом.

Двухцепочечные мо-
лекулы кДНК с синтети-
ческими липкими конца-
ми будут, конечно, взаи-
модействовать друг с
другом столь же активно,
как и с векторной ДНК.

Кроме того, сам вектор
может снова замкнуться к
кольцо, увеличив тем са-
мым число плазмид, не
участвующих в рекомби-
нации. Эти трудности в
значительной степени мо-
гут быть преодолены с
помощью обработки ли-
нейной плазмиды фосфа-
тазой (с. 141) и (или)

присоединения различных
линкеров к разным кон-
цам кДНК. По ориги-
нальной методике (Kurtz,

Nicodemus, 1981) к кДНК
одновременно присоеди-
няли два разных линке-
ра. Можно было ожидать,

что в результате этого процесса 50% молекул кДНК будут иметь на обоих концах одинаковые линкеры; такие молекулы не могут быть встроены в плазмидную ДНК с помощью направ­ленного клонирования..На практике эта цифра оказывается да­же выше, поскольку один из линкеров почти всегда присоединя­ется к кДНК быстрее, чем другой. Эту проблему можно разре­шить, добавляя к кДНК один линкер до расщепления петли

ОООООс

-f rr m

♦

Обработка

рестриктазами

*

Сшивание с плазмидной ДНК

Рис. 7.2. Клонирование кДНК методом по­следовательного присоединения синтетичес­ких линкерных ДНК.

214 ГЛАВА 7

шпильки нуклеазой S1, а другой после расщепления. кДНК с двумя линкерами затем может быть обработана подходящим ферментом рестрикции и встроена в плазмидный вектор с по­мощью направленного клонирования (рис. 7.2).

Этим методом можно встраивать в векторы кДНК в правиль­ной ориентации, позволяющей осуществлять экспрессию встро­енных последовательностей в бактериальной клетке (гл. 12). Он позволяет также идентифицировать интересующие исследовате­ля клоны путем отбора бактериальных колоний по наличию ма­териала, вступающего в реакцию со специфической антисыво­роткой к определенному продукту гена. Значение такой техники исследования особенно возрастает в случае клонирования мРНК> представленных в геноме малым числом копий, для которых от­сутствуют нуклеиновые кислоты — зонды.

При описанном подходе возникает одно затруднение, связан­ное с тем, что двухцепочечные гибриды кДНК — линкерная ДНК должны быть обработаны подходящими ферментами рест­рикции для образования липких концов (Scheller et al., 1977). Если двухцепочечная кДНК содержит один или несколько сай­тов рестрикции хотя бы для одной рестриктазы, она будет раз­резана и затем клонирована как два или несколько фрагментов ДНК, что затруднит анализ структуры полноразмерной кДНК. Это препятствие можно преодолеть, либо используя синтетиче­ские линкеры с сайтами рестрикции для ферментов, как прави­ло, не вносящих разрывы в ДНК млекопитающих (например, Sail), либо добавляя метилазу EcoRI для защиты ДНК отвоз- действия рестриктазы £coRI, либо применяя вместо линкеров синтетические адаптеры. Адаптеры — это короткие синтетичес­кие двухцепочечные кДНК, один конец которых тупой, а другой липкий (например, липкий конец для tfmdlll). Молекулы адаптера после присоединения 5'-фосфатной группы к их тупо­му концу и З'-гидроксильной группы к их липкому концу будут взаимодействовать с двухцепочечной кДНК с тупыми концами, но -не друг с другом. В отличие от линкеров перед присоедине­нием адаптеров к двухцепочечной кДНК их не надо расщеплять рестриктазами.

ДРУГИЕ МЕТОДЫ КЛОНИРОВАНИЯ кДНК

Большинство охарактеризованных к настоящему времени клонов, содержащих кДНК, было сконструировано при помощи описанных выше методов. Далее мы в сжатой форме описыва­ем три других метода клонирования кДНК. Применимость пер­вого метода — клонирования гибридов мРНК — кДНК — огра­ничена его низкой эффективностью. Второй метод включает син­тез второй цепи кДНК при использовании в качестве затравка олигонуклеотидов, тогда как по треьему методу синтезируются

СИНТЕЗ И КЛОНИРОВАНИЕ кДНК 215

первая м вторая дени кДНК с плазмидой в качестве затравки. Несмотря на то что последние два метода пока не нашли широ­кого применения и мы сами не имеем непосредственного опыта их использования, опубликованные данные указывают на то, что они служат эффективными способами получения клонов, содер­жащих полноразмерную кДНК.

Клонирование гибридов мРНК—кДНК

Этот метод клонирования кДНК включает трансформацию клеток Е. coli гибридами мРНК—«ДНК, пришитыми к ллазмид- яым векторам (Wood, Lee, 1976; Zain et al., 1979). В клетке бак­терии-хозяина мРНК удаляется и заменяется на ДНК. После синтеза первой цепи кДНК обычным способом к гибриду мРНК—кДНК присоединяют последовательность dA, после чего его отжигают с плазмидой, имеющей концевую dT-последова­тельность. Поскольку эффективность присоединения концевой последовательности к З'-ОН-группе РНК как минимум в 10 раз меньше, чем эффективность аналогичной реакции с ДНК, боль­шая часть добавленных к гибриду остатков dA присоединяется к 3'-концу цепи ДНК. Присоединение другого конца гибрида к вектору, по-видимому, осуществляется за счет образования во­дородных связей между природной poly (А)-последовательностью на З'-конце мРНК и концевой dT-последовательностью плазми­ды. Этот метод с практической точки зрения имеет два преиму­щества: во-первых, нет необходимости в синтезе второй цепи кДНК и, во-вторых, не требуется расщеплять шпильку в моле­куле ДНК нуклеазой S1. Кроме того, теоретически этот метод позволяет клонировать последовательности, находящиеся на 5'-коице мРНК (которые обычно теряются при обработке ну­клеазой S1). В то же время его основной недостаток состоит в том, что он по меньшей мере в 10 раз менее эффективен, чем клонирование двухцепочечной кДНК, и поэтому не подходит для получения большого числа клонов с кДНК.

Синтез второй цепи кДНК с использованием

в качестве затравки олигонуклеотидов

При синтезе второй цепи кДНК затравкой обычно служат структуры типа шпильки, находящиеся на З'-конце первой цепи. Другой метод состоит в прямом присоединении к концу кДНК последовательности oligo (dT) (Rougeon et al., 1975) или oligo (dC) (Land et al., 1981). Затем при использовании в качестве затравки соответственно oligo (dA)- или oligo (dG)-последова­тельности синтезируется вторая цепь, в результате чего образу­ется двухцепочечная кДНК, окруженная с двух сторон двух- цепочёчными гомополимерными последовательностями. После

216 ГЛАВА 7

этого к двухцепочечной ДНК присоединяют концевую oligo (dC)- последовательность и встраивают ДНК в плазмиду, разрезан­ную Pstl и несущую концевую последовательность oligo (dG).

Основное преимущество этого метода состоит в том, что в нем отсутствует сложная операция расщепления петли шпильки в двухцепочечной кДНК нуклеазой S1. Это повышает эффектив­ность клонирования полноразмерной двухцепочечной кДНК. Потенциальная опасность этого метода связана с тем, что да­же высокоочищенные препараты терминальной трансферазы за­грязнены примесями нуклеаз, специфически расщепляющих од­ноцепочечные участки нуклеиновых кислот. По всей вероятнос­ти, последнее препятствие можно преодолеть, присоединяя кон­цевую последовательность к первой цепи кДНК, находящейся в составе ДНК — РНК-гибрида.

Синтез первой и второй цепей кДНК с использованием в качестве затравки плазмиды

Недавно Окаяма*и Берг (Okayama, Berg, 1982) опубликова­ли новый метод высокоэффективного клонирования полнораз­мерной двухцепочечной кДНК. Метод включает следующие ста­дии (рис. 7.3).

1. Сначала к плазмиде-затравке для синтеза кДНК присо-. единяют терминальной трансферазой концевую последователь­ность oligo (dT). Затем путем расщепления вторым ферментом с последующими электрофорезом в агарозном геле и хромато­графией на oligo(dA)-целлюлозе (рис. 7.3,А) получают фраг­мент, содержащий один из dT-концов, точку начала репликации бактериальной ДНК и ген устойчивости к ампициллину.

2. Получают линкерпую ДНК с концевой последовательно­стью oligo (dG), присоединяя терминальной трансферазой эту последовательность к As/I-фрагменту ДНК и затем разделяя два конца вторым ферментом. Нужный концевой фрагмент очища­ют методом электрофореза в агарозном геле (рис. 7.3,5).

3. Вектор-затравку с концевой dT-последовательностью гиб- ридизуют с ро1у(А)-мРНК при молярном соотношении 1,5:3 (мРНК: вектор-затравка) и с помощью обратной транскрипта­зы синтезируют первую цепь кДНК (рис. 7.3, В).

4. К З'-концу синтезированной кДНК, все еще связанной во­дородными связями с мРНК-матрицей, присоединяют концевые oligo (dC)-последовательности. Последовательности dC, присо­единившиеся к другому концу вектора, затем удаляют с помо­щью рестриктирующей эндонуклеазы.

5. Плазмиду, содержащую в своем составе кДНК — мРНК* гибрид с oligo (dC) -последовательностью на конце, отжигают и сшивают с линкерной ДНК, имеющей концевую oligo (dG)-по­следовательность.

СИНТЕЗ И КЛОНИРОВАНИЕ кДНК 217

Лтр

HmdtC

Расщепление KpnI

Ир о Г____ _________

КрпI Присоединениекон-

PvuH цевых последова ■

те;пьностеи oligo tdT

терминальной трансферами

н. м J 117*

• I ■., ■

HmdST

Hpa I

-.nci III

Расщепление Hpa I

Очистка большого
фрагмента электро-
форезом в агарозном

I еле и хроматографиеи
м.! о1|до(0А)-цеплюпоэе

н I л d Ш

нроТ

? V 'J Ц

мРНК _ — — - д а д д д д

Pai щ|.'пление Pit i ₍ ¹ '. rs

П iH’i..¹ 11*ДИМ*‘НИ(* '

⁴ \

N

|>,|М,1.>въ * носледова ■ V. ■ т r?i' ьни(i ей oliqo'fHj гормональной i р а н ссь г р а jut*

мРНК

a 111

IJ ГГ p

■ i ■=? з к Д H К

' ^л oOp^^,H.'¹^

транслриш а юи

/

" p.::!i г,1 in.

P л (; щуп f l tr м и % r H f^f i '1 • H i

Очи^. i к а Md ПО' '•

мен т d,>лек т ю*.*

н аг ар01мом геп**

П [)\л <.' О в Д И *: Р М И е

КОНЦ*?ВЬ1> • Г •

■■■, п;л. ^{r J}

¹ - и i J. л¹ и.

■ d II! _ Г

Пинк>'р ■ кочцевоА писледонател и — in к i ьк.' i g'jiclG>

х

\

„ ungo(Mf.,

Т ерми nj'1 Г.НГД-

Замена цепи
РНК на ДНК
С помощью
PH Казь; Н £. СО/;',

Пик полимеразы I

г** О

и Дик лигазы 6 ■'

- д

т д т д

Р, J П

ИI г. й Ш

О? >»<и! с линкером, содержащим концевую последовательное’ь oiiqo(dG): образование кольцевои формы с помощью ДНКлигаэы

Р v j It

Psl I

Н>л<1 Ш

О

G._

Трансформаций клеток £ coh с приобретением ус^гоичивости к ампициллину'

Линкер с концевой последовательностью oligo(dG)

Рис. 7.3. Получение плазмидной затравки (А) и линкерной ДНК с концевой oligo (dG)-последовательностью (Z>). В. Стадии конструирования рекомбинан­тов плазмида—кДНК. Светлые части колец — ДНК pBR322; черные сегменты или сегменты с точками — ДНК вируса SV-40. Числа, расположенные рядом с обозначениями сайтов рестрикции, — соответствующие координаты на карте ДНК вируса SV40.

6. Цепь мРНК заменяют на ДНК, используя совместное дей­ствие ферментов: РНКазы Н, разрушающей цепь РНК в гибри­де РНК—ДНК; ДНК-полимеразы I Е. coli, осуществляющей репарацию разрывов во второй цепи кДНК; ДНК-лигазы, ката­лизирующей замыкание в кольцо молекулы ДНК за счет обра­зования ковалентных связей.

, Окаяма и Берг обнаружили, что большинство полноразмер­ных или близких к ним по размеру молекул кДНК превращает­ся в двухцепочечную кДНК; при этом эффективность трансфор­мации составляет около 100 000 трансформантов на 1 мкг исход­ной мРНК. Считается, что избирательное клонирование длин­ных кДНК-транскриптов обусловлено их преимущественным ис­пользованием терминальной трансферазой. Окаяма и Берг вы­двигают предположение о том, что более короткие цепи кДНК

Дата добавления: 2015-08-29