Т. Маниатис Э. Фрич Дж. Сэмбрук 6 страница

СИСТЕМЫ ВЕКТОР - ХОЗЯИН 61

^------- ₍--------- _т----------- 1----- 1-------- 1-------- г

£0 26 V7?8 29 30 31

' т— \ 1-- 1-------- [—

32 33 3 4 3S 36

■1 ■*

i

—г~

3<н

~~1—

•К;

-г-------- г^-

4; 40

“I-- г

4 4 4 0

1---- Г

"t I

4~

j - I < " ' ^{4 k} ’ ' ' ► «

- * Ct -i _n U •

V •, 1Л ¹ и > •

red ^K

e*o qan- гЩ rj. 4

rex

^ _a (Г. Ij yu у O' J CJ' о ^ t ^ O

° r IIJ a ^{L ai} ^ ¹ x < 'It tu - r r _L,, О > _T,

TJ r r I i-'

ac5

or

a

,0 ^{; J}cc

-«- 'J о ■ u - UJ

irr.nn 21 f ь

NIN 5 _r J--------------- L

I м и и л м у м)

■oRI

Погюжпнио:аи I OB pi ч: т рикциК

L- конец

Чу; П

Bani I

Kpn I
Kpn I

E'coRI

4.^r0 b560

■.'4 3ч¹.80ЬС '9940

Q *

,34

¥

л u;

t ¹

.._ \ • *

_hJ i '■i 3!

v-₀:

nq u H,} Li 4 kohol;

^J.;, ’

j - ^ i

¹: ⁷ К.. V’ ^J'V- 4; s

8,14

<h0

:n a t i

6,34

F=

Xhol

Примечание: Этот вектор интенсивно использовали Хогнесс и др. при созда­нии библиотек ДНК Drosophila. Существует производный фаг (Asep6-lac5A), который содержит амбер-мутации в генах Л и В (D. Goldberg, неопубликован- г^Л+^аИИЫС ^^{скомбш1а11ТЬ1} обоих фагов необходимо выращивать на хозяевах

к ^г

i л *

62 ГЛАВА I

т~

г

~Т-

"Г

Т“

т

Т

II

-Г"

кь

I

~г

т~

Т“

“Г"

Т-

"I- г~

19 20

-Т- 1---- г*

22 23 24

cos L

Nu3

Ы80

Фермент Вставка/замощение. Baml Замещение

XI059

Общая длина: 44,0 kb

Генетические маркеры: h^sBaml°bl89 (int29, NIN L44, с1857, pad29) Д

(int-cIII) КН54 sRl 4° NIN5 chi3

Замещение «балластного» фрагмента (содержащего гены red и gam) чуже­родной ДНК приводит к изменению фенотипа фага оо Spi⁺ на Spi"

Литература: Karn et al._t Ргос. Natl. Acad. Sci. US, 71, 5172, 1980

Карта фага /Л 059

Это вектор для клонирования больших BamHI-фрагментов, в котором замещение «балластного» фрагмента (содержащего гены red и gam) чуже­родной ДНК приводит к изменению фенотипа фага со Spi⁺ на Spi“. Вектор содержит область начала репликации ДНК плазмиды pBR322, что позволяет ему размножаться в лизогенных пег фагу X клетках в виде плазмиды (фаз-

на 1 мкг встраиваемой ДНК D. melanogaster (Ish-Horowicz, Burke, 1981).

Третья проблема, связанная с трудностью проверки большого числа бактериальных колоний на присутствие искомых последо­вательностей ДНК, была разрешена после разработки методики

СИСТЕМЫ ВЕКТОР — ХОЗЯИН 6$

-|------- 1------------ 1--- 1 1-- т г"

25 26 27 28 29 30 3'

~|----- 1-- 1----- 1 1-- 1- 1---- 1---------------- 1------- 1-- 1----- 1 1-- 1- 1---- 1---------------- 1------ г-

32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 43 4T^J

y-j

о£Г О о оо о ° Е о m с/j сп £

о -L X. Л.

а"вз^н"«н^‘

С О — -J — О — — ОТ - — „

t Q.C7‘> ^T:J^^T:,0C7‘>O^k‘0¹O^aQ-f^: ^

°itDo_?^ш^-ш<сотохХ(7|

CD XXX ш

int 29

-d t

NIN

L44

D—Г

amp¹

colicin

pod 29

Qlt

, " KH54

CD-------- С

NIN5

(максимум) 24,4 6,30 (минимум)

—q р:—i —i

^BomI.. Bom I

миды). Наличие этой последовательности, однако, затрудняет скрининг биб­лиотек с использованием в качестве зондов фрагментов, полученных из реком­бинантных плазмид. Даже после очистки в геле такие фрагменты неизбежно содержат небольшие количества последовательностей pBR322_t которые гибри- дизуются с бляшками нерекомбинантных фагов.

Еще одна трудность, возникающая при работе с этим вектором, заключается в том, что происходят спонтанные перестройки, приводящие к появлению в пре­парате родительского фага производных Spi“ (с частотой 0,1%). Как полага­ют, эти производные образуются в результате опосредованных int делеций, распространяющихся от сайта att внутрь области spi. Такая интерпретация подтверждается тем, что в препаратах производного int~ фага % 1059 (A-BF101) отсутствуют спонтанные фаги Spi^-

скрининга при высокой плотности колоний (с. 297) (Hanahan, Meselson, 1980).

Первыми, кто продемонстрировал возможность клонирования больших фрагментов ДНК в космидах, были Ройал с сотрудни­ками (Royal et al., 1979). Им удалось выделить из созданной в

64 ГЛАВА i

---- 1—	---- 1--- T~	—i--- r --	^1—T^-	1 ^1	■ T	1— I
* £i!	2.3 -	5 6				■ G Ii
		\u3		t П
\ _ ■ Д	'A ~	: d	г	f I 7 ! 1 1	Lj V 1	G т
					; 1
L-7 —^1		ii			► i ■.
0 I-		_ f ^r~^] ^ CD ^1		О a r.	to a:

-Г"

t2

~r~

“i--- Г"

19 2 С

“Г"

2i

—\- 1-- г

22 23 24

Т"

М

Т~

I

■щтг^т

. о 0£ *. □ f _т.

!/></> > О 1^л С1 г ' г-'

{Г, < <_> </> х ^ гг; ^

I I о

а. > Г CL

СО

U

П.

Ь189

Фермойг Вот I

Rc гавкл ^;;>а:чен и ■

Ja м г. и-ей;^г

XBF101

Общая длина: 4G,0 kb

Генетические маркеры: sBam Г b189 dupl[int29, NIN L44, с18Г>7 A (si IindlH 4-

Hindlll 3 pad29)] KH54, sRI 4° NIN5 chi3 Литература: N. Neff, неопубликованные данные

Примечание: Этот вектор получен из фага А1059 Нормой Нефф. Внутренний «балластный» фрагмент дуплицирован и две его копии интегрированы тандсм- по и ориентации, противоположной той, в которой он был в фаге А, 1059. Эго приводит к инактивации гена int. Вектор следует выращивать па хозяине тсс А~ (например, на штамме KRO), чтобы сохранялся дуплицированный бал' ластпып фрагмент. Замещение этого фрагмента (содержащего гены red и gam) чужеродной ДНК приводит к тому, что генотип фага изменяется с Spi⁴' на Spi~

Приблизительные размеры рестрикционных фрагментов (kb)

/JumHI	Hindlll	EcoRI
^20,0	—21,5	-25,0
8,3	8,3	8,3
8,3	11,6	9,2
9,4	4,6	3,6

Карта фага aBFIOI

Этот вектор получен из фага X1059, который был изменен в двух отноше­ниях. Во-первых, удален Hindi ll-фрагмент, содержащий последовательность

космидах библиотеки ДНК цыпленка два перекрывающихся фрагмента, которые вместе охватывают более 46 kb этой ДНК к содержат ген овальбумина и два овальбуминоподобных гена. Позднее были созданы космидные библиотеки ДНК Drosophila (Meyerowitz et al., 1980; Ish-Horowicz, Burke, 1981), мыши (Cat- taneo et al., 1981) и человека (Grosveld et al., 1981). Насколько

СИСТЕМЫ ВЕКТОР — хозяин 65

■ I I I I " I I " т

25 26 27 28 29 30 31

I ’“I I ¹ I------ Г—I-------------- 1-------------- 1 г Г I------------- Т I--------------- 1------ Г I ~Т г

32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 КЬ

ott

red К е*о дот _Го(

cos R

1Л

X ° ° ^ о О °

о. > ¹^_гУ^^С7'>0'о'о а о.р ^

I т а. £^тЕ?m<itD(E

XIX ы ^ш

о

CD

т

•о

CD

int 29

N1NL44

F ^Н

t -D

0 С

<30 ±

-d

ITT

NINL44

HI—EZ

о о

(Л1Л

£Г

О

о

^м в

О с

т -F

ТТ

о

со

тг 29

]

)

сг.

о

о

Ё

О

СП

СИ}

КН54

NIN5

(максимум! 24,4

Ват I

6,30 (минимум)

р=э—

Ват 1

плазмиды pBR322, с тем чтобы устранить трудности, обусловленные гибриди­зацией нерекомбинантных фагов (см. карту фага Я1059). Во-вторых, образо­вавшийся «балластный» BamHI-фрагмент инвертирован и дуплицирован, и тем самым инактивирован ген int (ср. карты фагов Х1059 и XBF101). Ген int инактивируют для того, чтобы исключить спонтанный фон фагов Spi“ в пре­парате родительского фага (см. карту фага Х1059). Препараты этого фага следует выращивать на штамме KR0 гесА~, чтобы предотвратить гомологич­ный, но неравный кроссинговер между дуплицированными BamHI-фрагмен­тами.

ценным является создание библиотеки ДНК человека в косми- дах, можно судить хотя бы по тому, что таким образом удалось выделить ряд перекрывающихся фрагментов ДНК, содержащих кластеры генов ^-глобина (Grosveld et al., 1981) и генов ia-гло­бина (Р. СЬагпеу, неопубликованные данные). Последние из этих рекомбинантов, выделенные с использованием самых совре­менных методов клонирования в космидах, оказались стабиль­ными при размножении в бактериях.

В заключение можно сказать, что клонирование в космидах разработано настолько хорошо, что в некоторых случаях явля­ется наилучшим из всех известных методов (например, при вы-

6—164

ее глава j

Сайт

|

оп I

Лигирование

/w^AЛллллллллллл/^ллллллл
Высокомолекулярная
эукариотическая

ДНК

Частичное расщепление рестри к тирующей эндонуклеазой

/WV'/WVWWV ЛЛЛЛ ЛЛЛЛЛ/ A/VWWW

________________ 1

t

A/VWV^VV\AA/VVWv^VWVVW'|^fWVW\yj

iff» i cm—(—*-hzzh-

Заражение клеток E. coli

| ^ Устойчивые к ампициллину трансформанты

Рис. 1.9. Клонирование в космидах.

делении больших генов или для проведения экспериментов по прослеживанию последовательности в хромосомах). Тем не ме­нее бактериофаг Я, по-видимому, и впредь будет самым лучшим вектором для рутинного создания библиотек эукариотических ДНК благодаря своей высокой эффективности и большей уни-

зерсальности.

СИСТЕМЫ ВЕКТОР —ХОЗЯИН

Hind III и фосфатаза

ОН----- [ cos 3

I—г^он

Sol BamHI

Sal I и фосфатаза Hmd Ш - fj-4~cos 1—

BamHI

I

I

Bam HI

OH---- l~cos"l

Г

Sal

n

| Bam HI

Hind Щ

L

OH OH

—Tcos V-OH

Смешивание

Лигирование с эукариотической ДНК, которая была подвергнута частичном/ расщеплению Mbol илиЗаиЗА и дефосфорилирована

Hind Ш

ОН

-Tcos)

Г

Sol

—'Аллллл/ууу^/'/уу'у-члал/ууучл—*--tcosh~-OH (В) ⁷ ■ (В)

37- 50 kb

J

-]---------------- ------------

Упаковка in vitro

Ряс. 1.10. Эффективное клонирование в космидах (Ish-Horowicz, Burke, 1981)»

БАКТЕРИОФАГИ, СОДЕРЖАЩИЕ ОДНОЦЕПОЧЕЧНУЮ ДНК

Из векторов-бактериофагов, содержащих одноцепочечную ДНК, наиболее совершенными в настоящее время являются век­торы на основе фага М13. Последний представляет собой ните­видный бактериофаг с кольцевой замкнутой ДНК длиной около 6500 нуклеотидов (Denhardt et al., 1978). Фаг М13 адсорбирует­ся на F-пилях Е. coli и потому способен заражать лишь мужские клетки бактерий (штаммы F' или Hfr). После проникновения в клетку одноцепочечная ДНК фага превращается в двухцепочеч­ную репликативную форму (РФ), которую можно выделить из клеток и использовать в качестве вектора для клонирования

б*

Размер: 5,4 kb

Репликон: ColEl, релаксированный Селективный маркер: Ашр^г Единичные сайты: BamHI, EcoRI, Sail Литература: Ish-Horowicz, Burke, 1981 Примечание: Космидный вектор, который исполь­зуется для клонирования больших £coRI- или BamHI-фрагментов с помощью методики, разрабо­танной Иш-Горовицем и Берке (Ish-Horowicz, Burke, 1981)

MUA-3

Размер: 4,7 kb

Репликон: ColEl, релакеированный Селективный маркер: Tet^r Единичные сайты: PstI, EcoRI, Clal Литература: Meyerowitz et al., 1980 Примечание: Космидный вектор, пригодный для

клонирования больших -фрагментов

СИСТЕМЫ ВЕКТОР —ХОЗЯИН. ©J

Kosl

Размер: 4,0 kb

Репликон: ColEl, релаксированный Селективный маркер: Tet^r

Единичные сайты: EcoRI, Bglll, PstI, Hindlll, Clal Литература: P. F. R. Little, неопубликованные данные

Примечание: Космидный вектор, пригодный для клонирования больших рес­трикционных фрагментов в сайте Bglll. Инвертированный повтор около сайта £coRI приводит к тому, что у некоторой доли молекул (<5%) в этой области оказываются небольшие делеции

двухцепочечной ДНК. После того как в клетке накапливается 100—200 копий РФ, синтез ДНК фага М13 становится асиммет­ричным и образуются большие количества лишь одной из двух цепей ДНК, а именно той, которая в конце концов войдет в сос­тав зрелых фаговых частиц. Эти частицы непрерывно выделя­ются зараженными клетками. Хотя клетки при заражении фагом М13 не погибают, их рост несколько подавляется, и потому этот вирус образует на бактериальном газоне мутные бляшки.

Основное преимущество фага М13 как вектора заключается в том, что выделяемые клеткой частицы бактериофага содержат одноцепочечную ДНК, гомологичную одной из двух комплемен­тарных цепей клонируемой ДНК. Такую ДНК можно использо­вать в качестве матрицы для определения последовательности ДНК по методу Сэнгера с использованием дидезоксинуклеоти- дов (Sanger et al., 1977). Разработаны векторы М13 и специ­фические ДНК-затравки (см. ниже), позволяющие провести сек-

7 0 ГЛАВА I

венирование из отдельного клона последовательности до 350 ос­нований (Sanger et al., 1977; Anderson et al., 1980). Быстрое секвенирование длинных участков ДНК удается осуществить пу­тем секвенирования перекрывающихся клонированных фрагмен­тов (Gingeras et al., 1979; Anderson et al., 1981). Кроме того, клоны M13 можно использовать как источник одноцепочечных ДНК-зондов для отбора РНК, а также в качестве субстрата при мутагенезе in vitro (Itakura, Riggs, 1980).

Основная трудность при клонировании в М13 связана с не­стабильностью больших вставок ДНК. Как правило, клониро­ванные последовательности длиной более 1000 нуклеотидов не­стабильны, и при размножении такого бактериофага появляются делеции. Однако вставки длиной 300—400 нуклеотидов оказы­ваются достаточно стабильными, чтобы их можно было приме­нять в указанных выше целях.

Векторы на основе бактериофага М13

За исключением участка длиной 507 нуклеотидов, названного межгенной последовательностью (МП), весь геном фага М13 содержит генетическую информацию, необходимую для реплика­ции этого вируса. Показано, что в участок МП можно встраи­вать чужеродную ДНК, и это не влияет на жизнеспособность фага* В производных М13, сконструированных для использова­ния в качестве клонирующих переносчиков, в эту область встрое­ны последовательности двух типов.

1. Первая из них представляет собой фрагмент /ас-оперона Е. coli, содержащий регуляторную область и последовательность

Таблица 1.2. Векторы М13 и используемые для клонирования сайты

Вектор

Сайты для клонирования

Источник данных

гпр5

тр7

тр8

тр9

EcoRV)

EcoR I -Mindll I-£coRI²>

EcoRl-BamHl-Sall-Pstl-Sall-BamHl,

E coR I

EcoRl-Smal-BamWl-Sall-Pstl-Hindlll HindUbPstl-Sall-BamHl-Smal-EcoRl³>

Gronenborn, Messing, 1978 J. Messing, личное сообще­ние

Messing et al., 1981

J. Messing, личное сообще­ние

J. Messing, личное сообще­ние

') Этот сайт появился не при включении линкерной последовательности, а в резуль­тате мутации, индуцировавшей сайт для £coRI в пятом кодоне гена $-галактозндазы.

^а) Структура сайта для клонирования в векторе шр5 сложнее, чем здесь показано. Этот сайт состоит из нескольких линкеров, расположенных тандемно и ограниченных С QtSeHX сторон по крайней мере двумя линкерами fcoRI.

³) В векторе шр9 полилинкер находится в ориентации, противоположной его ориен­тации в тр8.

СИСТЕМЫ ВЕКТОР — ХОЗЯИН 71

MI3 тр8. **

ATGACCAT GATTACGAATT CCCGGGGATCC

I_______________ I

EcoRI, Smal,

Xmal, BomHI _t

GTCGACCTGCAGCCAAGCTTGGCA

¹—-— ------- ¹ PstI Hind nt

Acc I

Hmc П

Рис. 1.11. Этот клонирующий вектор (mp8) создан Д. Мессингом на основе фага М13. Он содержит полилинкер, и потому в нем можно клонировать раз­нообразные фрагменты ДНК, полученные при расщеплении рестриктирующими эндонуклеазами. Вставка в полилинкер фрагмента чужеродной ДНК инакти­вирует ген р-галактозидазы, что позволяет очень просто выявлять те фаги, которые содержат такие вставки (по инактивации a-комплементации).

72 ГЛАВА 1

гана Z, которая кодирует первые 146 аминокислот р-галактози- дазы. Образуемая в зараженных клетках аминоконцевая часть р-галактозидазы способна комплементировать («а-комплемента- ция») с дефектной р-галактозидазой, которая кодируется мутант­ным геном в F-факторе клетки-хозяина. В результате такой комплементации получается активная р-галактозидаза, и если фаг и клетки выращивают в присутствии индуктора изопропил- тиогалактозида (IPTG) и хромогенного субстрата Xgal, то бляшки приобретают голубую окраску.

2. Последовательность второго типа представляет собой не­большой фрагмент ДНК (полилинкер), встроенный в «амино­концевую» часть гена р-галактозидазы и содержащий исполь­зуемые для клонирования единичные сайты для нескольких ре- 'Стриктаз. Эта вставка не влияет на способность образующегося фрагмента р-галактозидазы комплементировать с мутантной р-галактозидазой клетки. Однако встраивание в эту область до­полнительного фрагмента ДНК нарушает комплементацию. Со­держащие такой дополнительный фрагмент фаги образуют на среде с IPTG и Xgal бесцветные бляшки. Схема канонического клонирующего вектора М13 приведена на рис. 1.11. Клонирую­щие векторы М13 различаются в основном находящимися в по­лилинкере рестрикционными сайтами. В табл. 1.2 перечислены сайты для клонирования, содержащиеся в используемых в на­стоящее время векторах.

Специфические небольшие фрагменты ДНК, которые исполь­зуются в качестве затравок при секвенировании клонированных ДНК, теперь субклонируют в плазмидах (Anderson et al., 1980) или синтезируют химическим путем (Rothstein et al., 1980), и оик имеются в продаже. Эти затравки гомологичны области ге­на,р-галактозидазы, расположенной в векторе М13 непосредст­венно рядом с областью полилинкера..

выводы

Как уже говорилось в начале этой главы, четыре типа век­торов— плазмиды, бактериофаг X, космиды и бактериофаг М 13— обладают особыми биологическими и физическими свой­ствами, позволяющими использовать их для решения различных задач клонирования. Отличительные свойства и основные приме­нения каждого из этих четырех типов векторов суммированы в табл. 1.3.

Космиды и различные штаммы бактериофага К способны включать большие фрагменты чужеродной ДНК, и потому они используются как векторы для конструирования и размножения библиотек геномных ДНК эукариот. Однако они довольно не­удобны в качестве векторов для работы с небольшими фрагмен­тами ДНК и для их подробного анализа и, по крайней мере в

СИСТЕМЫ ВЕКТОР— ХОЗЯИН 73 Таблица 1.3. Основные применения различных векторов в клонировании

Бактерио-

Плазмиды ^БаК_ф^ТГ°- Космиды

ДНК

Клонирование больших фрагмен­тов ДНК	±^1]	+	~Ь
Создание геномных библиотек	—		+	—
Создание библиотек кДНК		---	---	---
Обычное субклонирование	-L [	---	---	---
Создание новых конструкций ДНК	_]L		—
Секвенирование	+.1	—	---	+
Создание одноцепочечных зондов	—2)	—■	—
Диализ экспрессии чужеродных генов в Е. coli	+	____ _	- ■

') Хотя четкого верхнего предела размера ДНК, которую можно клонировать плазмидных векторах, не существует, эффективность трансформации и выход ДНК ре* комбинантных плазмид, содержащих вставки ДНК более 10 kb, оказываются очень низ+- кими.

²) Сконструирован плазмидный вектор, содержащий в одной цели ДНК последова­тельность poly{dA), а в другой — poly(dT) (Hayashi et al., 1980). После клонирования* в этом векторе цепи линеаризованной рекомбинантной ДНК можно разделить с помощью- хроматографии на oligo(dT)- и oligo(dА)-целлюлозе*

настоящее время, не подходят для создания библиотек кДНК-

Векторы для клонирования, содержащие одноцепочечнук> ДНК, используются главным образом при получении матриц для секвенирования методом терминирования цепей по Сэнгеру с ис­пользованием дидезоксинуклеотидов и как источник отдельных цепей ДНК для гибридизации нуклеиновых кислот. Относитель­ная нестабильность вставок ДНК размером 1 kb не позволяет использовать одноцепочечные бактериофаги для большинства других целей.

Плазмиды широко используются в самых разнообразных, процедурах клонирования. Они способны включать фрагмента) ДНК средних размеров, что позволяет применять такие векторы? для субклонирования библиотек геномных ДНК, созданных на основе космид или бактериофага Я. Плазмиды содержат много удобных сайтов рестрикции, что неоценимо при создании новых конструкций ДНК. Это единственные векторы, удобные для кло^ нирования кДНК. Наконец, создано большое число плазмида к которых кодирующие участки клонируемой ДНК можно постам вить под контроль очень эффективных бактериальных промото­ров. Такие векторы, свойства которых подробно описаны в гл. 12, используют для анализа экспрессии чужеродных генов в Е. coli■

В Приложении В приведен список использованных в этом руководстве бактериальных штаммов.

Глава 2

РАЗМНОЖЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ШТАММОВ И ВИРУСОВ И ОБРАЩЕНИЕ С НИМИ

Микробиологические методики, которые используются при молекулярном клонировании, очень просты и не долж­ны представлять затруднений для тех, кто владеет основ­ными приемами работы в стерильных условиях. Чаще всего приходится сталкиваться с двумя трудностями: с перекрест­ным загрязнением штаммов и с утратой или появлением новых генетических маркеров. Оба эти затруднения можно свести к минимуму, если проводить очистку колоний или бляшек, а затем проверять генотип штамма. Следует избе­гать последовательного пассирования штаммов-и получать культуры, с которыми ведется работа, из проверенных ос­новных культур, содержащихся на длительном хранении.

Даже в лучших лабораториях, где работа ведется на самом высоком уровне, может произойти загрязнение куль­тур, и важно проверять культуры на появление бактериаль- ^: ных колоний с измененными морфологией, цветом или за­

пахом, а препараты фага на появление бляшек необычного

1 размера или на образование бляшек на необычных хозя­евах. Чашки с несоответствующей культурой, как и любые чашки, загрязненные плесенью или другими грибами, нуж- ' но отобрать, проавтоклавировать и выбросить.

ПРОВЕРКА ШТАММА

. При получении нового штамма бактерии или бактериофага его нужно рассеять и отобрать отдельные колонии или бляшки. Затем нужно вырастить культуры в небольшом объеме и соот­ветствующим образом проверить генотип этого штамма. В книге Миллера (Miller, 1972) подробно описано, как следует прово­дить такую проверку бактерий. Соответствующие генетические тесты для бактериофагов обычно приводятся в той публикации, где описано, как создан данный штамм и как его размножают. Перечень генетических маркеров, которые часто приходится про­верять, приведен в табл. 2.1. Структура ДНК векторов должна быть подтверждена при расщеплении в аналитических пробах этих ДНК соответствующими рестриктирующими ферментами.

Дата добавления: 2015-08-29