Т. Маниатис Э. Фрич Дж. Сэмбрук 4 страница

СИСТЕМЫ ВЕКТОР — ХОЗЯИН 43

-~г~

?д

т~

~г~

ч U

—г~

—г~

ьс кЬ

ctt

IПГ 5 1,

red

ex;

rex

cl

(

— B‘

^r-'¹ x; ^ 1.7 <

^ X

m

/7

П

I I II Г(

I I' I 1 I '1 '1 I

:j! oo e. о

-j

LJ

□ — T "■* — “ ~ — П — — LT О С L _йст>‘ои'отзст,о'17г,йа

° x £ cl ¹г^:Е^^ичх.Т1-'Г1 2D I X X U-

- F о СП

о

v;

£3

&

ill 11

о

-С.

ж

imrr 80

к.н53

EHI

"TT"

о о

</) СП

-о

□

Положение

(минимум)

шш-шш

жно

2,82 О

ЖШ]Р

Xho I Xho I

ш

4.4

РЕ

Xhol

6,86

Sol I Soil

8,5

P

Soil

Soli ‘

сайтов рестрикции
L-конец	. c
Bgi I
Bam I	55 6C
Kpn I	174 30
Kpn I	1895C
EcoRI	I994C
Sst I	2Ю40
Xbo I
Sst I
н tnd Ш
Ssi I
EcoRI
Hmd Ж	2792C
Bom I	285Ю
Bgl Я	338Ю
Xho I
Bg! 2
Kpn I
Bglfl •
Sal I
Sol I
Kpn I
Bgll
Bom I
Ssi I
Hind Ш
Bom I
Kpn I
Bgl Q
Sst I
Bom I
Bgl П
R-конец 48180

Xhol *

Soli

Литература: Blattner F. et al, 1977, Science. 196, 161: Williams B., Blaltner F„ 1979, J. Virol., 29, 555; de Wet J. et al.. 1980, J. Virol.. 33, 401 Примечание: Этот вектор используется для гоздания библиотек, полученных при полном расщеплении эукариотической ДНК рестриктазой EcoRI

[

illl ‘ '

и

u.

Ф i ■ f i м' * и I R⁽ f. i н к _ri.4 м f ■ щ' * н и * ■

... - (M Л К и M M. 20,1

XbO I &< Т..ИК:. 4\\\\\\\\\\^VT

• r ■-; <■ r, i

Xapoii 4 A

Общая длина: 45,4 kb

Генетические маркеры: A am 32, Baml, lac5, bio256, VKH54, VNIN5, ^80 QSR Образует голубые бляшки n чашках с Xgal. Нуждается в бактерин-хозяинс с

супрессором suIII

Трудности, связанные со второй проблемой, можно свести к минимуму, если: с космидным вектором лигировать фрагменты эукариотической ДНК определенной длины (30—45 kb). Встраи­вание в одну космиду двух или более таких фрагментов приве­дет к образованию молекулы, которая окажется слишком боль­шой; чтобы она могла упаковаться в частицу бактериофага X.

Недавно был описан другой метод клонирования в космидах, обходящий первые две из указанных трудностей (Ish-Horowicz, Burke, 1981). В соответствии с предложенной процедурой, кото­рая была разработана для вектора pJB8 и схематически изобра­жена на рис. 1.10, препарат космидного вектора разделяют на две порции, каждую из которых расщепляют своим рестрикти- рующим ферментом; первый из этих ферментов делает разрыв с одной стороны от последовательности cos, а второй —с другой стороны от этой последовательности. Получающиеся в резуль­тате линейные молекулы ДНК дефосфорилируют, обрабатывая щелочной фосфатазой. Именно это дефосфорилирование пред­отвращает образование при лигировании тандемов векторов и снижает фон бактериальных колоний, содержащих космиды без

СИСТЕМЫ ВЕКТОР — ХОЗЯИН 45

-Г--- 1 г~ г

-1---- 1-- г

I ■ J '

~г

* *.

~1------------ 1----------- г

•V.;.1

-I- j-- 1- г

< ' -4^м 'V'¹ И,D

<-■». С' 1^,г

тт

:г

1ч

L. •

:r ^г ‘ ‘ ’

,; Г г

t

IT

* п

■ li м^1: \:^1: "

Т- Т ’ _Г

^{1 L} гг: т

к1

' * ' ' ^...3 ■ ■

С' м * t

v¹ t Ч

* tT)

кччччччч^ччччччччч^а

. >
- ■ гз Ц ' ’

] ^

Л)

(Т <т СС 21

-О

J L

□

П с¹ п (>ж* ‘н и⁽ ■ гаитой рог г дикции

71 (М И Н И М \ м

’ ^-гь

г i с W1

х\\\ччччч\ччч\ч^\чч^

1 к О Н 1' ц		\ (о RI
Bgi П	4 7C	Bg: 3	359 60
Bom I		Bq^1 П	36 320
Kpn I	i 74 3C	Bq I
Kpn I	189 50	Bq, П	370 30
Е со R1		Bom 1	3944C
Sst I	2i040	Sst I
Xba I	24 960	HindUI
Sst I		Bam I
Hmd Ш	2562C	Kpn I	4I83C
Sst I		Bg: П
EcoRI		Sst I
Hind Ш		Bom I	438 70
■Bam I		Bgi П	4 4050
Bgl H	32 510	R-конец
Bgl П		\

Литература: Blattncr F. et al., 1977, Sciencc, 196, 161; Williams В., Blattner F., 1979, J. Virol., 29, 555; de Wet J. et al., J980, J. Virol., 33, 401 Примечание: Этот вектор широко используется для создания библиотек фраг­менте)» эукариотической ДНК размером 15—20 kb

вставок. Затем обе дефосфорилированные ДНК расщепляют рестриктазой BamHI и смешивают их, чтобы получить липкие концы, которые можно лигировать с фрагментами эукариотиче­ской ДНК, полученными при частичном расщеплении рестрик­тазой Mbol или Sau3A с последующим дефосфорилированием. При такой процедуре получается лишь один тип способных упа­ковываться молекул, которые содержат фрагмент с «левым» сайтом cos, вставку длиной 32—42 kb и фрагмент с «правым» сайтом cos. Вектор pJB8 обладает тем дополнительным преиму­ществом, что он содержит два сайта для EcoRI, расположен­ных с обеих сторон от BamHI-сайта недалеко от него. Это поз­воляет почти точно вырезать встроенную ДНК. Методику эту, однако, легко приспособить и к другим существующим космид­ным векторам (с. 68—69). Эффективность метода достаточно высока, и при его использовании получают более 5-10⁵ клонов

zz

NIN 5

% -
u
UJ

V)

Фермейт Вставка/замещение

HindlH

EcoRI

■Soli

Sst I

Xbo I

Xhol

Замещение

Замещение

Замещение

Замещение

Вставка

Вставка

EcoRI/Hindu Замещение

(максимум) 17,06 — =1

4,06 (минимум)

Hind Ш

HindHt

11,27

ч

EcoRI

EcoRI

5,Ю О

1 F

Soli Soil

9,90

Sst I

SstI

4,60 0

д
XboI Xbalш	4,60 0
	, ■ IL.

Xhol Xhol

22.74

EcoRI

9,74

Положение сайтов рестрикции

L-конец
Bgtl
Bam I
' Kpn I
Kpn I
EcoRI
SstI	2Ю40
Xbal
SstI
HiruJIH
SstI
EcoRI
HindHI
Bom I
Soil
Sail
Xhol
Bam I
BglQ
HmdlH
Hindi
Bgl I
Bgin
BylE
R-конец

Sst i /Hmdm

Xbo I / Hmd Ш

EcoRI /Soil

EcoRI /Xho I

Sst I/Sol I

Xbo I /Sol I

Sol I/Xhol

Sst I/Xho I

Xbol/Xhol

Замещение

Замещение

Замещение

Замещение

Замещение

Замещение

Замещение

Замещение

Замещение

*2',64

Sst I

8.64

18,4 7

EcoRI 18,7 3

EcoRI

17,37

’

Ssf I

17,63

SstI

17,72

УЬа I

13,46

Xbol

13.71

Ц

Xbol

5,47

Soli

5,73

Xho I

4,37

•Soli

0.46

Soli 5.37 *

^c-g! I Xho I

4.63

C.7I

p-

Xhol

Харон 17

Общая длина: 46,4 kb

Генетические маркеры: Iac5, NIN5, clam, Fee-. Образует голубые бляшки в чашках с Xgal. Образует лизогены в бак- териях-хозяевах с супрессором sull или suIII Литература: Williams В. G., Blattner F. R., 1979, J. Virol., 29, 555

НтбШ

4.72

Hind 12

48 ГЛАВА 1

—-- г

(■' Г I

О.V AS С 1 1

Ф(;р М ("*Н т

. i Г.' л I ИИ< '

м;н> I’M; г** *

; а

1V-.г Hi

Харои 20

Общая длина: 40,36 kb

СИСТЕЛШ ВЕКТОР - хозяин 49 •*

”1—

?*>

-г~

СП

'Т~

2Q

—г^-

?.9

~г~

I

П—

Ч-j

~Г"

' * I.

г j

г

ЬЧ.'О

■► К L~S

К

4v;

ш

□

г'^^{: 11} (минимум!

I I ОЛ j/^ СИ И ■-

catn jh:..'vC г у. и г.:/■/

L ■ к он о:: h j

' I

ж

^r' I - ^

зд

И,n С

‘‘^sl

4^

!^u^r ►J n I

’4'V

ч - ■ *, ^

^ 5 о с

1 ' ■''

s

Генетические маркеры: Ы007, NIN5, imm434 Литература: Williams В., Blattner F., 1979, J. Virol., 29, 555

4- К/

50 глава ]

-- I-- I-- I-- I-- I! I I-- I- 1- 1- 1-- 1- 1- 1- 1- 1-- 1- 1- 1- 1-- 1-- 1- 1- 1?—

Kb I 2 3 4 5 6 7 8 S *0 I' 12 13 14 15 16 18 19 20 21 22 23 24 25 26

cos L Nul

W B'

I i

"Ё c.. m x

Nu3 FE

D E FI 2 t V G

i I I 1 I I

fi

M

К I

tea

л:

a

viii^SS iiif

с

Cl

tn (л > о и a n л ел <t о со х гп

LmJ ^

CQ

"И

Я tn ТЗ 1/>

£ сл = ю

Wom.

Earn

b 1007

сс

о

О

Т

в

"'О

с

Фермент Встав ка-замещение

Hind Ж

Вставка

(максимум) 91 о(^мин)

HmdIH HindHI

EcoRI

Вставка

9,1 0

EcoRI EcoRI

Sol I

Вставка

Xhol

Вставка

EcoRI / HindШ

Ktndffi/ Sol I

Hind Ш /Xho I

EcoRI/Sal I

EcoRI/XhoI

Замещение

Замещение

Замещение

Замещение

Замещение

11,05 К

=1 Р-

EcoRI Hind Ш 19.15

Hind Ш

15,25

Hmd Ж

21,08

EcoRI

17.19

Eco RI

Xhol/Satl

Замещение

Харон 21A

Общая длина: 41,7 kb

Генетические маркеры: Wam403, EamllOO, imro80, Vbl007, VKH53, VKH52, VNIN5. Нуждается в бактерии-хозяине с супресоором supE или supF

т

СИСТЕМЫ ВЕКТОР —ХОЗЯИН 5|

—I--------- 1 1--------------------------------------------------------- 1 1----------------------------------------- 1---- 1------------- 1 1--------------------------------------------------------- 1 г--------------------------------------- 1 г I I------------ 1 1--------------------------------------------------------- 1 1----------------------------------------- г---- 1------------ г

~2J 28 29 30 31 32 33 34 -35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 К&

к -3 о -О > Ё о > о- с о CL Х

ш ^Х

red К exo gam сШ го

г ^с

cl о П 0 Р

cos R

о а: о о иод о £

£ о -£--5 тсг)(Л

«.у.¹¹

- X3^J'2'0|>>0>l>oQ.Q.C v\ □

ж о imi |®||ю<®т uii««|g

immeo KH53 KH52

MR!

=1 ddd a

t=>

NIN5

Положение сайтов

91 о

w

Sail Soli

- 9.10

.

Xho I Xhol

рестрикции
L-конец
ВдШ
Bom I
Kpn I
Kpn I
EcoRI
BamI
Bgi I
HindHI
Bgi I
Xhol
Bgl I
Kpn I
Bgl I
Soli
Kpn I
Ball
R-конец 41890

6,15

H

Soli

2.26

Xhol

4,19

Xhol

8J

Soli

13,0

Xhol

SolX

нипом Л?^аАт«г п^{ЛаТТНер и Д}Р,\ ^{Заявка на} систему вектор — хозяин для кло­нирования ДНК. Приложение IX. Данные о Хароне 21А

^Этот бактериофаг широко используется в качестве вектора для

польчов_Я^^апп^^НТ0В' 9" ^содеР^жит амбер-мутации, и потому его удобно ис-

ользовать при рекомбинационном скрининге с плазмидой nVX

Дата добавления: 2015-08-29