Методы применяют для выявления антигенов микробов, определения гормонов, ферментов, лекарственных веществ и иммуноглобулинов.

А. РИА — высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген—антитело, один из компонентов которой несет радиоактивную метку. Метод позволяет обнаруживать как антигены, так и антитела и определять их концентрацию в исследуемой пробе.

Б. Иммунофлюоресцентный анализ также применяют для выявления как антигенов, так и антител. Этот метод основан на использовании реагентов, меченных флюоресцентным красителем. Антитела чаще всего метят флюоресцеина изотиоцианатом. Меченые антитела связываются с антигеном, образуя комплексы, которые можно выявить с помощью флюоресцентной микроскопии. Существуют три модификации иммунофлюоресцентного анализа.

1. Метод прямой иммунофлюоресценции применяют для выявления антигенов. Он основан на непосредственном связывании антигена, сорбированного на твердой подложке, с мечеными антителами. Реакцию оценивают с помощью флюоресцентного микроскопа.

2. Метод непрямой иммунофлюоресценции позволяет выявить антитела к известному антигену. Антиген, сорбированный на твердой подложке, связывается с немечеными антителами. Комплексы антиген—антитело выявляются с помощью меченых антител к иммуноглобулинам.

3. Метод конкурентной иммунофлюоресценции основан на связывании стандартного меченого и присутствующего в исследуемой пробе немеченого антигенов с антителами, сорбированными на твердой подложке. Поскольку меченый и немеченый антигены конкурируют за связывание с антителами, по количеству связанного меченого антигена можно определить концентрацию антигена в исследуемой пробе.

В. Методы, основанные на реакции преципитации. При взаимодействии растворимых антигенов с антителами образуются высокомолекулярные комплексы антиген—антитело, которые выпадают в виде осадка в растворе или откладываются в виде полос преципитации в геле. Использование очищенных антигенов позволяет определить концентрацию антител в исследуемой пробе.

1. Преципитация в растворе. При добавлении антигена в возрастающей концентрации к одному и тому же количеству антител выпадает разное количество преципитата. Можно построить график — кривую преципитации, — который отражает зависимость между концентрацией антигена и количеством преципитата: при избытке антител количество преципитата возрастает с увеличением концентрации антигена, в зоне эквивалентности (количество антигена примерно равно количеству мест связывания на антителах) образуется максимальное количество преципитата, при избытке антигена количество преципитата уменьшается с увеличением концентрации антигена.

2. Иммунодиффузия — наиболее распространенный из всех методов, основанных на реакции преципитации (см. гл. 20, пп. I.Б—В).

а. Простая радиальная иммунодиффузия. Суть метода заключается в следующем: 1) в тонком слое геля, содержащего антитела в известной концентрации, вырезают лунки; 2) антиген, помещенный в эти лунки, диффундирует в гель; 3) вокруг лунок образуются кольца преципитации, диаметр которых пропорционален концентрации антигена. Метод обычно применяется для определения концентрации иммуноглобулинов.

б. Двойная радиальная иммунодиффузия. Суть метода заключается в следующем: 1) в тонком слое геля вырезают лунки для антигена и антител; 2) антиген и антитела диффундируют навстречу друг другу, образуя линии преципитации на некотором расстоянии от лунок. По расстоянию от лунки с антигеном до линии преципитации можно определить концентрацию антигена.

3. Электрофорез

а. Иммуноэлектрофорез представляет собой сочетание двух методов — иммунодиффузии и зонального электрофореза. Иммуноэлектрофорез применяется в основном для исследования сывороточных белков. Суть метода заключается в следующем: 1) в лунку, вырезанную в тонком слое геля, помещают исследуемую сыворотку; 2) проводят электрофоретическое разделение белков сыворотки; 3) в геле вырезают бороздку, параллельную направлению миграции белков при электрофорезе, и заполняют ее смесью антител к сывороточным белкам; 4) разделенные при электрофорезе белки (антигены) и антитела диффундируют навстречу друг другу. В местах связывания антител с антигенами образуются дуги преципитации (см. гл. 20, п. I.А).

б. Встречный электрофорез. Суть метода заключается в следующем: 1) исследуемые антигены и смесь антител помещают в лунки, расположенные на противоположных концах пластины с гелем; 2) вдоль линии, соединяющей лунки, пропускают постоянный электрический ток; 3) в электрическом поле антитела и антигены быстро перемещаются по направлению друг к другу; 4) в месте связывания антигенов с антителами образуются линии преципитации. Встречный электрофорез применяют в тех случаях, когда антигены и антитела обладают разной электрофоретической подвижностью. Этот метод позволяет быстро определить антигены или антитела в исследуемой пробе и применяется в экспресс-диагностике инфекционных заболеваний.

Г. Методы, основанные на реакции агглютинации, довольно чувствительны и применяются для выявления антигенов на поверхности клеток или частиц и полуколичественного определения антител к этим антигенам. Суть методов заключается в следующем: при связывании клеток или частиц, покрытых антигеном, с антителами образуются крупные агрегаты. Для определения титра антител к поверхностным антигенам клеток или к антигенам, сорбированным на поверхности частиц, смешивают известное количество клеток или частиц, покрытых антигеном, с разными разведениями исследуемой пробы, например сыворотки.

1. Реакция прямой агглютинации применяется для выявления поверхностных антигенов микробов или клеток крови и антител к этим антигенам. Суть метода заключается в следующем: серийные разведения исследуемой пробы (например, сыворотки) смешивают с клетками, за титр антител принимают величину, обратную максимальному разведению сыворотки, которое вызывает агглютинацию. Этот метод более чувствителен, чем методы, основанные на преципитации, поскольку при равной концентрации антигена объем агглютината больше объема преципитата. Реакция агглютинации не зависит от температуры, если только не обусловлена холодовыми агглютининами, которые более эффективны при температуре ниже 37°C.

2. Реакция непрямой агглютинации основана на агглютинации эритроцитов, других клеток или частиц (например, латекса или бентонита), покрытых антигеном. Для определения титра антител серийные разведения сыворотки в физиологическом растворе смешивают с известным количеством покрытых антигеном клеток или частиц. Реакция непрямой агглютинации — чувствительный метод, позволяющий определять растворимые антигены в низких концентрациях.

Д. Реакция связывания комплемента. Суть метода заключается в следующем: 1) антиген смешивают с антителами; 2) к образовавшимся комплексам антиген—антитело добавляют известное количество комплемента, который связывается с этими комплексами; 3) количество несвязанного комплемента оценивают в реакции гемолиза с эритроцитами барана.

Е. Твердофазный ИФА — надежный, экономичный и высокочувствительный метод. Он основан на использовании стандартных препаратов очищенных антигенов или антител, ковалентно связанных с ферментом. Эти препараты сохраняют и иммунологические свойства, и ферментативную активность, которую можно измерить при добавлении субстрата данного фермента.

Пример диагностики токсоплазмоза.

Токсоплазмоз. Возбудитель — Toxoplasma gondii. Заражение происходит через фекалии кошек и при употреблении сырого мяса. Инфекция нередко протекает бессимптомно, но может проявляться лихорадкой, спленомегалией, увеличением лимфоузлов. У больных с иммунодефицитами токсоплазмоз проявляется тяжелыми миокардитом, пневмонией, энцефалитом, менингитом или менингоэнцефалитом. Острая инфекция во время беременности может привести к врожденному токсоплазмозу. Диагноз токсоплазмоза обычно ставят по результатам серологического исследования. Чаще всего используются метод непрямой иммунофлюоресценции и реакция непрямой гемагглютинации. Диагностически значимым считается не менее чем четырехкратное повышение титра антител. Для выявления IgM к возбудителю применяются методы прямой и непрямой иммунофлюоресценции и твердофазный ИФА. Антитела к возбудителю появляются через 1—2 нед после начала заболевания, их титр возрастает в течение примерно 6 нед (до 1:600 и выше), затем снижается в течение 6—8 мес. IgG к токсоплазмам могут сохраняться на протяжении всей жизни.

а. Метод непрямой иммунофлюоресценции — наиболее распространенный метод диагностики токсоплазмоза, позволяющий выявить IgG и IgM к Toxoplasma gondii. Титр антител, выявляемых с помощью этого метода, соответствует титру антител, выявляемых в реакции Сейбина—Фельдмана. Диагностически значимым считается титр 1:64 и выше.

б. Реакция Сейбина—Фельдмана. Суть метода заключается в следующем. Ядро и цитоплазма клеток Toxoplasma gondii, не покрытых антителами, в присутствии метиленового синего окрашиваются в темно-синий цвет. Клетки возбудителя, обработанные сывороткой, содержащей антитела к нему, не окрашиваются этим красителем. Диагностически значимым считается не менее чем четырехкратное повышение титра антител. В период разгара инфекции титр антител, выявленных в реакции Сейбина—Фельдмана, обычно достигает 1:1000 и более. Эту реакцию в настоящее время почти не применяют, поскольку она проводится с живыми возбудителями. Предпочитают использовать метод непрямой иммунофлюоресценции.

в. Реакция непрямой гемагглютинации — простой, точный и недорогой серологический метод, который часто применяется для выявления IgG к токсоплазмам. В большинстве лабораторий диагностически значимым считается титр 1:256 и более. Эта реакция может оставаться положительной в течение нескольких лет.

г. Реакция связывания комплемента применяется редко, поскольку ее оценка не стандартизирована. Положительным считается титр антител не менее 1:4. В период разгара заболевания он обычно повышается до 1:32. Реакция связывания комплемента остается положительной в течение нескольких месяцев или лет.

Б. Серодиагностика нематодозов основана на выявлении паразитов и их яиц в кале. Токсокароз встречается в основном у детей дошкольного возраста, механизм заражения — фекально-оральный. Возбудители токсокароза — Toxocara canis и Toxocara cati — самая частая причина висцеральной формы синдрома larva migrans. Личинки паразита из ЖКТ попадают в кровь и разносятся по организму. Характерные симптомы — лихорадка, бледность, кашель, одышка, сухие хрипы, гепатомегалия, которые обычно сопровождаются эозинофилией, гипергаммаглобулинемией и повышением титра изогемагглютининов. Изредка отмечаются эпилептические припадки. Поскольку яйца токсокар почти никогда не обнаруживаются в кале, диагноз токсокароза ставят при выявлении в сыворотке антител к паразиту. Готовые наборы для твердофазного ИФА можно получить в Центре по контролю заболеваемости.

Дата добавления: 2015-08-02