ДНК-зонды, рестрикционный анализ, ПЦР

С развитием молекулярной биологии стало возможным гибридизировать фрагменты ДНК (и РНК) и были разработаны различные методы, пр. лигазная цепная р-ция, Q-β-система и др. Гибридизация – это процесс восстановления водородных чвязей по принципу комплементарности после разделения 2-нитевой молекулы ДНК.

Этапы рестрикционного анализа

1. выделение ДНК. Используется фермент рестриктаза («генетические ножницы»), специфичная для исследуемого участка ДНК

2. разделение полученных фрагментов ДНК (э/форез: чем меньше Mr, тем дальше уходит фрагмент)

3. необходим. фрагмент метят (ДНК-зонд. Зонды м.б. маленькими – олигонуклеотидными- и большими – ДНК-овыми)) и добавляют к гомологичным фрагментам. Происходит гибридизация. Метку выявляют.

Недостаток этого метода – потребность в большом кол-ве материала, поэтому наибольшее распространение нашла ПЦР (метод предложил Мюллис, 1983), основное преимущество которой – высокая чувствительность (теоретически для получения рез-та достаточно иметь в среде одну молекулу ДНК). В основе метода – катализируемая ДНК-полимеразой амплификация определенного участка ДНК, основной принцип метода – мультипликация.

Этапы метода: термическое разделение 2-нитевой молекулы ДНК на отдельные участки (30-40 сек при 93-95^оС), охлаждение среды и внесение праймеров, комплементарных нуклеотидным последовательностям обеих цепочек. Для запуска используют синтетические праймеры – олигонуклеотиды, состоящие из 10-20 нуклеотидов, вз-вующие с окончаниями последовательностей и обр-щие последовательности в 50-1000 оснований. Затем в среду вносят термостабильную taq (по назв-ю бактерии Thermus aquaicus)-полимеразу, что запускает образование вторичных копий цепей ДНК, после чего образующиеся 2-нитевые молекулы ДНК снова подогревают. Образующиеся отдельные цепочки остужают, вносят праймеры и снова повторяют процедуру подогрева и охлаждения; термостабильность полимеразы обусловливает стабильность фермента и отсутствие необходимости в его повторном внесении. Р-ция проводится в амплификаторе, обеспечивающем оптимальную смену температур. После 30-80 циклов накопления копий ДНК проводят их идентификацию методом э/фореза. Для подтверждения принадлежности ДНК возб-лю молекулы м.б. подвергнуты рестрикции специфическими эндонуклеазами, ДНК-гибридизации, секвенированию (англ. sequence – последовательность). Секвенатор – прибор, считывающий нуклеотидные последовательности фрагментов ДНК; полученные рез-ты по принципу гомологии сравниваются с ранее изученными последовательностями (ДНК-банки). Также проводится анализ плазмидного профиля (выделение плазмид и их идентификация)

а) для DSки инф. заб-ий маркером возб-ля является его геном. Для амплификации выбирают его наиболее консервативную часть (какой-нибудь уникальный ген), наиболее четко отличающую его от других патогенов.

б) для запуска синтеза на ДНК-матрице используют 2 праймера, комплементарные нити на обоих концах специфич. фрагмента. Вз-вие с праймерами называют отжигом (р-ция проходит за 20

б) в рез-те достраивания цепей ДНК в специфическом фрагменте под д-вием термостаб. полимеразы (оптимум реакцион. способ-ти 70-72^оС) формируется специфический фрагмент – ампликон. После окончания первого цикла проводят повторные циклы; синтезированные в них ампликоны также будут служить матрицами для последующих циклов. За 30-40 циклов из одной матрицы можно получить 10⁸ ампликонов.

Принципы т/ф методов анализа. Им/люминесцентные методы DSки инфекционных заболеваний.

На предметное стекло (тв. фаза) с фиксирован. мазком (фиксация пламенем горелки либо химическая – ацетон, спирт), где присутствует Ag, наносят меченое At (метка – флюорохром→МФА, фермент→ ИФА, изотоп→РИА. Если они специфичны друг другу, то образуется ИК, который при последующей отмывке сохраняется, а меченое At затем выявляется соответствующим способом. (Принципы – фиксация и отмывка). Наиболее распространенный метод – ИФА, где Ag фиксирован на пластмассе с определенной сорбционной активностью – полистирол, полихлорвинил)

МФА, ИФА, РИА – прямые т/ф методы. По чувствительности: МФА<ИФА<РИА

Метод двойных антител (сэндвич-варианты). На тв. фазе фиксировано At, которое реагирует с Ag. После отмывки добавляют меченое At, снова отмывают и выявляют меченое At соответствующим способом

Дата добавления: 2015-08-02