Определение содержания общего белка биуретовым методом

Студент должен знать молекулярные механизмы свертывающей противосвертывающей систем крови, роль печени в этом процессе, молекулярную структуру коагуляторов, механизм гемофилий различного генеза, уметь определять биохимические показатели состояния свертывающей системы и давать им медикобиологическую оценку, знать нарушения вo фракционном составе белков плазмы крови.

Содержание общего белка в сыворотке (плазме) крови является показателем состояния человеческого организма в норме (нормопротеинемия) или нарушения белкового обмена (гипо- и редко гиперпротеинемия) при различных заболеваниях желудочно-кишечного тракта, печени, сосудистой системы.

Самым распространенным химическим методом количественного определения белков является колориметрический метод, основанный на биуретовой реакции. В щелочной среде пептидные связи белка переходят в енольную форму и образуют с Cu²⁺ комплексное соединение, окрашенное в фиолетовый цвет.

Окраска растворов при проведении биуретовой реакции варьирует от синей до красной с преобладанием фиолетовой и зависит от количества азота, участвующего в образовании комплекса. Чтобы рассчитать концентрацию белка, строят предварительно калибровочный график зависимости интенсивности окрашивания, измеряемой на ФЭКе от заведомого содержания белка в растворе.

Оборудование и реактивы: фотоэлектрокалориметр, пробирки, пипетки, мерные колбы, раствор альбумина плацентарного 10%, сегнетова соль, медный купорос, калий иодистый, натрий хлористый, гидроксид натрия.

Готовят биуретовый реактив, растворяя в мерной колбе на 250 мл 0,375г CuSO₄×Н₂О и 1,5г сегнетовой соли в 150мл воды, приливая медленно 75мл 10% NaOH, и доводят содержимое до 250мл водой. Рабочий раствор биуретового реактива готовят, смешав 200 мл биуретового реактива с 800мл 0,5% раствора иодистого калия.

Построение калибровочного графика

Из калибровочного раствора плацентарного альбумина готовят рабочие калибровочные растворы, как указано в таблице:

№ п/п	Калибровочный р-р белка (мл)	0,9% р-р NaCl (мл)	Концентрация белка в г/л
	0,4	0,6
	0,6	0,4
	0,8	0,2
	1,0	-

Из каждого разведения берут 0,1 мл рабочего раствора и прибавляют по 5,0 мл рабочего биуретового реактива. Через 30 – 60 мин измеряют на ФЭКе оптическую плотность в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 540 - 560 нм (зеленый светофильтр) против контроля (к 5 мл рабочего биуретового реактива прибавляют 0,1 мл 0,9% раствора хлористого натрия). По полученным данным строят калибровочный график.

Ход работы. К 0,1мл сыворотки прибавляют 5,0 мл рабочего биуретового реактива и смешивают, избегая образования пены. Через 30 мин (и не позднее, чем через 1 час) измеряют оптическую плотность на ФЭКе, как при построении калибровочного графика против контроля (биуретового реактива).

По калибровочному графику определяют содержание белка в пробе и выражают его далее с учетом разведения в процентах в целом препарате.

Дата добавления: 2015-07-20