Глава 2. Материалы и методы.

Материалы:

Контрастные средства:

1) Примовист

Действующее вещество: гадоксетовая кислота (Gadoxetic acid).
Состав и форма выпуска: раствор для внутривенного введения 1 мл динатриевая соль гадоксетовой кислоты (Gd-EOB-DTPA)181,430 мг (соответствует концентрации 0,25 ммоль/мл)

вспомогательные вещества: калоксетовой кислоты тринатриевая соль; трометамол; хлористоводородная кислота; натрия гидроксид; вода для инъекций.

Форма выпуска: предварительно наполненных шприцах из бесцветного стекла типа 1 (Евр.Фарм. или USP) объемом 10 мл с наполнением 10 мл.

2) Гадовист

Действующее вещество: гадобутрол* (Gadobutrol*)
Состав и форма выпуска: раствор для внутривенного введения (1 ммоль/мл)

1 мл гадобутрол 604,72 мг

вспомогательные вещества: калкобутрол натрия; трометамол; хлористоводородная кислота (0,1 М); вода для инъекций.

Форма выпуска: в стеклянных шприцах по 7,5 мл; в герметичном контейнере из ПВХ и ламинированной бумаги 1 шприц.

3) Магневист

Действующее вещество: гадопентетовая кислота* (Gadopentetic acid*)
Состав и форма выпуска: раствор для внутривенного введения 1 мл гадопентетат димеглумина 469,01 мг (соответствует 0,5 ммоль/мл)

вспомогательные вещества: меглумин; пентетовая кислота (ДТПА); вода для инъекций

Форма выпуска: флакон 20 мл.

Реактивы:

Натрия хлорид раствор для инфузий 0,9%. Концентрация натрия (Nа+) - 145 ммоль/л; концентрация хлорида (Сl-) - 101 ммоль/л («Биосинтез»,Россия).

Бычий сывороточный альбумин кристаллизованный в концентрации (2,4,6 г/дл).

Билирубин (С₃₃Н₃₆N₄O₆) («Риахим», Россия)- взяты навески 0,001г

Методы:

Методика получения МРТ изображения

Технические характеристики томографа:

Данное исследование проводились на магнитно-резонансном томографе «MAGNETOM Verio» [42] (рис. 7) с напряженностью поля 3Тл (фирма «Siemens»).

Сверхпроводящий магнит с центральным отверстием. Диаметр круглого отверстия 70 см.

32 - канальная Tim (Total imaging matrix) технология, благодаря которой формируется единая виртуальная катушка.

Tim - передовая технология организации радиочастот­ного тракта, повышающая как диагностическое качество изображений, так и клиническую производительность.

Система электрооборудования - источник питания, блок фильтров, градиентные катушки и щит питания.

Радиочастотный комплекс –передатчик РЧ - импульсов, передающая катушка и РЧ – приемник.

Система управления – блок радиоэлектроники, блок управления и видеоадаптер.

Система экранирования.

Длина магнита 173 см.

Вес 6300 кг.

Магнит с нулевым показателем испарения гелия не требует регулярного пополнения запаса этого дорогостоящего вещества, при этом система готова к работе постоянно.

Рисунок 7. Внешний вид МР томографа «MAGNETOM Verio» [42]

Syngo- это программно-аппаратный комплекс, который представляет собой мультимодальную станцию для просмотра, анализа и объемного представления данных МР исследования [43].

Средства МР просмотра – используется для просмотра изображения и работы с ним. В окне просмотра может содержаться одно большое изображение, оно также может быть разбито на несколько кадров для одновременного просмотра нескольких изображений. Изображение можно загрузить с любого локального или удаленного устройства хранения данных. С изображением или группой изображений можно работать индивидуально при помощи таких функций, как изменение масштаба и настройка окна. Кроме того, можно прокручивать изображение и создавать снимки.

Для исследования применялась аксиальная проекция, так как это дает максимальное количество одинаковых срезов и позволяет полностью прорезать пробирку, что исключает сомнения в негомогенности полученного образца. Все результаты были обработаны в программе Statistica.

Регламент эксперимента.

Главной задачей эксперимента было сравнение контрастных средств. Все эксперименты проходили в одинаковых условиях при одинаковой комнатной температуре 24 градуса.

Каждая серия измерений Т1(табл. 2) повторялась по 8 раз, что дало возможность проверить достоверность данного эксперимента. Все пробирки, использованные в эксперименте на 4 мл, содержание их было 2мл, диаметр пробирок по 10мм, что позволяет точно визуализировать изображение (Рис. 3).

В первой серии были проверены все контрастные средства при их исходных концентрациях в разведении на воде для инъекции. Все полученные R1 (это релаксирующая способность МРКС влияет на времена релаксации протонов, нормированная на концентрацию МРКС вычисляется по формуле ((1/Т1с МРКС – 1/Т1 без МРКС)/(1/концентрацию))), соответствовали приведенных в литературе, что говорит о качественности и подлинности тех контрастных средств, которые использовались.

Рисунок 8. Внешний вид пробирок

Для первой серии были взяты все средства в исходных концентрациях и разведены в 10, 100, 1000 и 10000 раз и одна пробирка была контроля.

В следующей серии были взяты контрастные средства в исходных концентрациях и доведены были до одинаковой концентрации, для этого потребовалось развести Магневист в 2 раза, а Гадовист в 4 раз. Затем так же как и в предыдущей серии все контрастные средства были разведены в 10,100,1000 и 10000 раз. Таким образом, мы получили концентрации исследуемых средств 25, 2,5, 0,25 и 0,025 ммоль/л. Затем вместо воды для инъекции контрастные средства развели в физиологическом растворе, содержащим белок - сывороточный альбумин. Для изучения концентрационной зависимости белок был взят в трех различных концентрациях: 20,40 и 60 г/л.

В последней серии эксперимента в пробирки с содержанием белка в концентрации 40 и 60 г/л, был добавлен билирубин в количестве 0,001г (что составляет 160 мкмоль/л - рассчитано на пробирку 2мл).

В ходе эксперимента были использованы следующие импульсные последовательности для оценки эффективности контрастных средств.

Т1 –взвешенное изображение с помощью импульсной последовательности спин-решетчатой релаксации, которая реализована в томографе как Т1-anatomical,для измерения сигнала Т1 в конкретной точке.

Т2 –взвешенное изображение с помощью импульсной последовательности мульти спин-эхо, которая реализована в томографе как Т2-anatomical,для измерения сигнала Т2 в конкретной точке.

Параметры использованных импульсных последовательностей представлены в таблице 2.

Таблица 2. Основные параметры исследованных импульсных последовательностей.

  Методика обработки МРТ изображений В качестве инструмента для визуализации МРТ изображений и измерений исследуемых характеристик использовался программный пакет Syngo. Syngo-прикладная компьютерная программа, разработанная компанией Siemens. Продается со всей продукцией Siemens и не реализуется свободно. Имеет обширный арсенал возможностей работы с изображением: Для открытия серии изображений, полученных с томографа MAGNETOM Verio, необходимо выбрать пункт в меню «File/Import/Image Sequence», далее открываем подкаталог с реконструированными изображениями нашего файла. Для вычисления интересующих параметров использовался метод полуавтоматической сегментации. Сперва производится разделение серии на отдельные изображения «Image/View/Stripe». Далее отбирались изображение, которые захватывали центральные части пробирки. Затем во вкладки Tools выбиралась окружность, как зона измерения, в каждой пробирки было измерено 0,13 квадратных сантиметров. Автоматически программа выдавала подсчитанный сигнал Т1 и стандартное отклонение в выделенной зоне на выбранном срезе (см. схема 1).

Глава 3. Результаты и обсуждения:

Главной задачей экспериментов стало сравнение позитивных контрастных средств, поэтому основными критериями их сравнения стали параметры Т1 и R1.

У всех запатентованных магнитно-резонансных средств есть известные значения R1 (это релаксирующая способность МРКС влияет на времена релаксации протонов, нормированная на концентрацию МРКС вычисляется по формуле ((1/Т1с МРКС – 1/Т1 без МРКС)/(1/концентрацию))), поэтому в первой серии экспериментов сравнивались данные полученные практически с приводимыми в литературе.

Значение R1 зависят от того на каком аппарате производили измерения, в нашей работе эксперименты проходили на 3 Т МР-томографе (Таблица 2).

Таблица 2. Сравнение значений R1 для МРКС (желательно в каждом случае указать напряжённость магнитного поля).

Значение R1 из литературы [31]	Значение R1 экспериментальные
Магневист	3,1±03	Магневист	3,3±0,3
Гадовист	3,2±0,3	Гадовист	3,4±0,3
Примовист	4,3±0,3	Примовист	4,6±0,3

При анализе литературных данных для существующих препаратов необходимо учитывать разницу в значениях релаксирующей способности для сред содержащих и не содержащих белки. Данные для плазмы крови при температуре 37 градусов Цельсия свидетельствуют, что влияние среды на свойства препарата Гадовист существенно больше по сравнению с Магневистом. На Примовист так же среда оказывает большое влияние и меняет его релаксационные свойства (Таблица 3).

Таблица 3. Сравнение значений R1 для МРКС в воде и плазме при температуре 37C^o. (желательно в каждом случае указать напряжённость магнитного поля).

Значение R1 в H2O [31]	Значение R1 в плазме [34]
Магневист	3,1±03	3,8±0,2
Гадовист	3,2±0,3	5,0±0,2
Примовист	4,3±0,3	6,2±0,3
	Все числа полученные экспериментальным путем входят в границы допустимых значений всех трех данных средств, что говорит об их качестве и о чистоте следующих экспериментов, в которых сравнивался Т1, так как все концентрации брались одинаковые, чтобы можно было сравнить связывается ли Примовист с белком альбумином или нет, и как себя ведут другие контрастные препараты при разной концентрации белка. Концентрация альбумина в норме у человека от 34-48г/л [44], поэтому мы использовали белок в разных концентрациях: 20г/л, 40 г/л и 60 г/л. Первая серия при одинаковых концентрациях была измерена с разведением контрастных средств водой для инъекции (рис. 9,10). На рисунке 9 мы видим, что Т1самое высокое у Гадовиста это говорит о том, что его свойства средства при такой, концентрации хуже остальных, для сравнения вода имеет Т1=3000мс. Магневист и Примовист при концентрации 0,25ммоль/л имеют приблизительно одинаковые значения, но при большем разведении видно, что Магневист имеет Т1 меньше, что указывает на то, что контрастирующая способность у него лучше в отсутствие белков. На рисунке 10 представлена скорость релаксации равная 1/Т1. При высокой концентрации (чего) мы видим высокую скорость, но при понижении концентрации, скорость падает и становится почти одинаковая у всех контрастных средств. По этому критерию мы сможем более достоверно говорить о связывание альбумина с контрастными веществами. В первой серии мы видим, что Примовист и Магневист имеют графики скорости релаксации очень похожие, только Магневист имеет скорость релаксации выше. Из выше сказанного можно сделать определенный вывод. Магневист при одинаковой концентрации с другими контрастными средствами на воде имеет релаксационные свойства выше. Время и скорость релаксации у Примовиста максимально приближена в концентрации 0,25 ммоль/л (что соответствует рекомендуемой дозе введения пациенту) к времени релаксации Магневиста.       Рис. 9. Зависимость значения времени релаксации(Т1) от концентрации контрастных средств при их разведении в воде для инъекции.
Следующая серия была этих же контрастных средств разведенных в альбумине в концентрации 20 г/л (Рис. 11,12). На рисунке 11 мы видим, что при попадании контрастных средств в белковую среду происходит изменение сигнала. Гадовист по-прежнему имеет самые высокие числа Т1, но можно заметить, что эти числа меньше предыдущих, что указывает, на то,а что альбумин снижает сигнал Т1 (альбумин имеет сигнал 2500мс). Так же на рисунке видно, что Магневист по-прежнему имеет самые низкие числа Т1, что говорит о его хороших контрастирующих свойствахлучших качествах, как контрастного средства. Так же можно заметить, что у Примовиста значения Т1, значительно приближенные к Магневисту, но по этим данным нельзя точно сказать, эти числа такие из-за начало связыванияе этоксибензильной группы с альбумином или из-за общего влияния альбумина на сигнал, но изменение концентрации альбумина должно внести определенную ясность. На рисунке 12 видно, что Примовист обладает самой высокой скоростью релаксации, при высокой концентрации, но при большем разведении, его скорость значительно падает., но Магневист имеет при меньшей концентрации скорость выше, чем у Примовиста. По этой серии эксперимента можно сказать, что скорость релаксации значительно увеличивается при появлении в растворе альбумина, но особенно сильно скорость увеличилась у Примовиста в 3 раза, что говорит о его связывание с белком.
В третей серии экспериментов мы брали концентрацию альбумина 40 г\л, что максимально приближено к концентрации альбумина в плазме человека (рисунки 13,14).
Рис. 12. Зависимость значения времени релаксации (Т1) от концентрации контрастных средств в присутствии альбумина в концентрации 40 г/л.

Рис. 13. Зависимость скорость релаксации (1/Т1) от концентрации контрастных препаратов средств в присутствии альбумина в концентрации 40г/л.

На рисунке 12 мы видим, что альбумин повлиял на релаксационные свойства 3 контрастных средств. Гадовист по-прежнему имеет самые высокие числа Т1. Магневист стал иметь более высокие значение Т1 по сравнению с Примовистом, что говорит о том, что Примовист при связывании с белком изменяет свою релаксационную активность и обладает низким Т1, что помогает ему делать контрастность вещества более высокой. На рисунке 13 заметно, что скорость релаксации Примовиста больше при всех разведениях контрастного средства в присутствии белка в физиологической концентрации.

Для того, чтобы подтвердить роль белкового связывание в релаксационной активности Примовиста, мы добавили контрастные средства в среду с еще большим содержанием альбумина - при его концентрации 60 г/л (рисунки 14,15).

Рис. 14. Зависимость значения времени релаксации(Т1) от концентрации контрастных средств в присутствии альбумина в концентрации 60г/л. При большей концентрации белка количество гадоксетовой кислоты, находящейся в связанном состоянии, повышается и одновременно увеличивается скорость релаксации Примовиста. Все полученные данные были оценены в виде зависимостиь скоростиь релаксации от концентрации альбумина, при концентрации контрастного средства 0,25 ммоль/л, так как эта концентрация может быть после введения является рекомендуемой дозыой для пациентов (0,1 мл/кг) (рисунок 16).   Рис. 16. Зависимость скорости релаксации(1/Т1) контрастных средств от концентрации альбумина в физиологическом растворе На рисунке 16 видно, что с ростом концентрации альбумина увеличивается скорость релаксации сигнала МРКС. Особенно ярко выражен этот эффект в случае Примовиста. Полученный результат, по-видимому, обусловлен связыванием МРКС с альбумином. Однако в случае Магневиста достоверных различий в скоростях релаксации при повышении концентрации альбумина от 0 до 20г/л и от 20 до 40 г/л. не выявлено. Способность Примовиста связываться с белком плазмы крови имеет большое значение для клиники. Исследование МР достаточно долгое, и если контрастное средство образовывает связь с альбуминов в крови человека, это помогает дольше визуализировать патологию. Примовист является контрастным средством специфичным для клеток печени человека и соответственно его часто используют для изучения печеночных патологии. Нам известно, что при заболеваниях печени часто бывает повышен билирубин в крови. Из литературных источников известно, что это может повлиять на качество МР исследования. Мы сочли целесообразным промоделировать ситуацию гипербилирубинемии для всех изучаемых контрастных средств и провести их сравнительное изучение в данных условиях. Для этого в каждую пробирку, в которой содержалось 2 мл исследуемого белка и контрастного средства был добавлен 0,001г билирубина и получилась его концентрация 160 мкмоль/л (что превышает норму в крови человека в 10 раз-норма 8,5-20,5 мкмоль/л).

Пробирки с контролем, в которых находился чистый альбумин без контрастных средств, моментально связался с билирубином и образовалось соединение, которое дало очень низкий сигнал Т1(было 2500мс, а стал 200мс). Поэтому несвязанный альбумин начинает связываться с билирубином и дает более низкий сигнал, особенно это заметно на концентрации белка 0,25ммоль/л. Следует особо отметить, что числа, полученные при эксперименте Примовиста с белком в концентрации 40г/л без билирубина, практически такие же, как и с билирубином, что говорит о том, что связь этоксибензильной группы с альбумином не зависит от образуемой связи альбумина с билирубином. Убедиться в этом нам поможет следующий эксперимент (рисунок 18).

Рис. 18. Зависимость Т1(мс) от концентрации контрастных препаратов в присутствии альбумина с концентрацией 60 г/л и билирубина в концентрации 160 мкмоль/л.

Можно сравнить значение скорости релаксации до и после применения билирубина, это даст более наглядную картину влияние билирубина на контрастные средства (рисунок 19).

На рисунке мы можем видеть, как меняется время релаксации в пробирке, в которой находится физиологический раствор с сывороточном альбумином, при добавлении билирубина. Время релаксации до добавленияе билирубинаальбумина в пробирке в 10 раз выше, чем после него, что говорит нам о том, что альбумином связывается с билирубином.

Рис. 19. Влияние билирубина в концентрации 160 мкмоль/л наЗависимость значения Т1 растворов контрастных средств в присутствииконцентрации альбумина от значения Т1 при добавлении билирубина в концентрации 160мкмоль/л. Концентрация контрастных средств 0,25ммоль/л.

Только сигнал от Примовиста постоянен – значения Т1 до и после добавление билирубина практически не изменились, что говорит об устойчивом соединение и отсутствии влияния гипербилирубинемии на релаксирующую активность Примовиста при проведении артериальной фазы исследования. При применении Примовиста мы можем объективно оценить изображения, основываясь на контрастности полученной картинки.

При применении Гадовиста присутствие билирубина усиливает его контрастирующую активность, а при применении Магневиста может ее уменьшать, что, по-видимому, следует учитывать в клинике.

Выводы:

1) Cывороточный альбумин повышает скорость релаксации растворов Примовиста и Гадовиста с 1,6 до 3,3 (1/с) и с 4,3 до 8,13 (1/с) соответственно. В случае Магневиста наличие белка не влияло на его релаксирующую способность.

2) Гипоальбуминемия может уменьшать контрастирующие свойства Примовиста и Гадовиста, в меньшей степени Магневиста. При гипоальбуминеральбуминемии следует возможно следует использовать Магневист или Гадовист, так как контрастирование печени в артериальную фазу в случае Примовиста может оказаться недостаточнымиспользовать контрастные средства Гадовист и Примовист.

3) Билирубин в концентрации 160 мкмоль/л (в 10 раз превышающую норму в плазме человека) уменьшает время релаксации Гадовиста и увеличивает его у Магневиста в растворе сывороточного альбумина (40 г/л) с 302 до 227(мс) и с 167 до 204(мс) соответственно, но не влияет на время релаксации Примовиста. При г Можно рекомендовать применения Примовиста для контрастирования печени, в том числе, и в условиях гипербилирубинемии в артериальную фазу исследования печени контрастирующие способности Примовиста не должны меняться, но они могут уменьшиться в случае Магневиста.и.

Дата добавления: 2015-07-25