Стратегия пептидного синтеза

Схематично рассмотрим синтез дипептида ГЛИ-ЛЕЙ.

Для осуществления синтеза пептида с заданной последовательностью α-аминокислот необходимо выполнить ряд последовательных операций.

Первый этап синтеза — защита аминогруппы одной аминокислоты. С помощью реакций ацилирования в аминогруппу вводят электроноакцеп­торный заместитель. По окончанию синтеза эту защиту снимают.

В качестве реагентов для защиты чаще всего используют карбоксибензилхлорид C₆H₅CH₂OCOCI или третбутоксикарбонилхлорид — (СНз)₃СОСОС1:

3.2.1. Определение первичной структуры белков

Определению первичной структуры предшествует денатурация и разрыв поперечных дисульфидных связей в белке. Это достигается посредством из­бытка меркаптоэтанола:

Как видно из уравнения, цистин превращается в два остатка цистеина, ко­торые затем блокируют избытком иодуксусной кислоты, чтобы предотвратить обратное образование связей — S—S—.

Расщепление полипептидной цепи на фрагменты проводят обычно при помощи протеолитических ферментов, таких, как трипсин, химотрипсин или пепсин. Эти ферменты действуют на различные участки полипептидной цепи, так как имеют повышенное сродство к различным аминокислотным остаткам. Трипсин гидролизует только те пептидные связи, в образовании которых участвует кар­боксильная группа лизина или аргинина, а химотрипсин гидролизует связи по фенилаланину, триптофану и тирозину. Далее определяют аминокислотные последовательности каждого полипеп­тидного фрагмента. Для этого чаще всего используют метод Эдмана, заклю­чающийся в анализе полипептида только с N-конца. Концевая аминокислота при взаимодействии с фенилизотиоцианатом в щелочной среде образует стой­кое соединение, которое можно отщепить от полипептида без его деградации. Фенилтиогидантоиновое (ФТГ) производное аминокислоты идентифицирует­ся хроматографическим методом. После идентификации концевого N-амино­кислотного остатка метка вводится в следующий аминокислотный остаток.

Ф. Сэнгер впервые полностью расшифровал первичную структуру белко­вого гормона инсулина, используя метод Эдмана.

Первичная структура белка может быть установлена косвенно следующим образом: сначала получают соответствующую кДНК, затем идентифицируют клон, относящийся к анализируемому белку, и по чередованию в нем нуклеотидов с использованием библиотеки аминокислотных последовательностей определяют первичную структуру белка.

Дата добавления: 2015-07-16