Биологические системы, использующиеся в биотехнологии

Объектами молекулярной биотехнологии являются самые разнообразные биологические системы: микроорганизмы, клеточные линии насекомых, растений и млекопитающих, вирусы насекомых, растений и млекопитающих, многоклеточные организмы (растения, мыши, домашние животные и т.д.) – выбор системы зависит от целей эксперимента. Характер биологической системы исключительно важен для биотехнологического процесса. Во многих случаях именно генетически модифицированная самовоспроизводящая биологическая единица – микроорганизм, вирус, растение или животное – является конечным коммерческим продуктом. Среди множества биологических объектов, использующихся в молекулярной биотехнологии, основными "рабочими лошадками" являются бактерии Escherichia coli, одноклеточные дрожжи Saccharomyces cerevisiae и различные клеточные линии животного происхождения. Все они играют важную роль в получении белков, кодируемых клонированными генами.

Технология рекомбинантных ДНК (ее называют также молекулярным клонированием или генной инженерией) – это совокупность экспериментальных процедур, позволяющая осуществлять перенос генетического материала (дезоксирибонуклеиновой кислоты) из одного организма в другой. Никакого единого, универсального набора методик здесь не существует, но чаще всего эксперименты с рекомбинантной ДНК проводят так: из организма – донора нужных генов – экстрагируют нативную ДНК (клонируемая ДНК, встраиваемая ДНК, ДНК-мишень, чужеродная ДНК), подвергают ее ферментативному гидролизу (расщепляют, разрезают) и соединяют (лигируют, сшивают) с другой ДНК (вектор для клонирования, клонирующий вектор) с образованием новой, рекомбинантной молекулы (конструкция "клонирующий вектор–встроенная ДНК"). Эту конструкцию вводят в клетку-хозяина (реципиент), где она реплицируется и передается потомкам. Этот процесс называется трансформацией. Идентифицируют и отбирают клетки, несущие рекомбинантную ДНК (трансформированные клетки). Получают специфический белковый продукт, синтезированный клетками-хозяевами, что служит подтверждением клонирования искомого гена. Предпосылками к созданию технологии рекомбинантных ДНК послужили многие открытия в области молекулярной биологии, энзимологии нуклеиновых кислот и молекулярной генетики бактериальных вирусов и внехромосомных элементов бактерий (плазмид). Конструирование рекомбинантных молекул осуществляется с помощью целого арсенала ферментов – обязательного и незаменимого инструмента практически всех этапов этого сложнейшего процесса.

Вводя в геном растений чужеродные гены и обеспечивая их экспрессию, можно относительно быстро создавать новые сорта растений. Уже получены трансгенные растения, устойчивые к неблагоприятным условиям окружающей среды, к насекомым-вредителям, вирусам, гербицидам, окислительному и солевому стрессам. Выведены культуры с необычной окраской цветков, растения, имеющие более высокую пищевую ценность, растения с измененным вкусом плодов и т.д. Некоторые растения удалось модифицировать так, что они стали своеобразными фабриками по крупномасштабному синтезу ценных белков, например антител. Многочисленные трансгенные растения с измененными свойствами и повышенной пищевой ценностью прошли успешную проверку в лабораторных, а некоторые из них – в полевых условиях. К настоящему времени на рынок поступило лишь небольшое число генетически модифицированных растений, однако можно с уверенностью сказать, что в будущем они займут на нем достойное место.

Генетическая модификация животных при помощи технологии рекомбинантных ДНК (трансгеназа) основана на введении клонированного гена в геном клетки, которая могла бы дать начало клеткам зародышевой линии. Скрещивая трансгенных потомков, появившихся в результате такой операции, можно получить гомозиготные линии трансгенных животных. Большинство исследований в этой области проводилось на мышах. Обычно для этого с помощью микроинъекции вводили клонированный ген в оплодотворенную яйцеклетку мыши, имплантировали ее в реципиентную самку и проверяли потомство на наличие введенного гена. Чужеродный ген можно вводить в оплодотворенную яйцеклетку мыши и с помощью ретровирусного вектора. Альтернативный подход заключается в выделении мышиных эмбриональных стволовых клеток и трансфекции их клонированным геном. Таким образом были получены мыши, синтезирующие только человеческие антитела. Их использовали в качестве модельных систем для изучения генетических болезней человека (например, болезни Альцгеймера).

С помощью аналогичных экспериментальных подходов были получены трансгенные коровы, овцы, свиньи, птицы и рыбы. Есть надежда, что трансгеноз позволит улучшать генотип существующих пород домашнего скота и выводить породы животных с новыми признаками. Кроме того, возможно, таких домашних животных, как коровы, овцы и козы, удастся использовать в качестве своеобразных "биологических фабрик" для получения продуктов клонированных генов, секретируемых в молоко.

Немаловажное значение молекулярная биотехнология имеет и непосредственно для самого человека. Изучая родословные семей, представленных несколькими поколениями, члены которых имеют четко выраженную патологию, можно определить тип наследования многих генетических заболеваний. Для идентификации нужного гена человека в молекулярной биотехнологии применяют разные методы. Например, кандидатное картирование, которое основывается на выборе генов, которые по имеющимся данным могут отвечать за данное генетическое заболевание. В этом случае проводят поиск мутаций в генах-кандидатах у больных и здоровых индивидов и по результатам поиска делают вывод, какой из них является геном заболевания. Для многих наследственных заболеваний никаких достаточно эффективных способов лечения не существует, и во многом это связано с трудностями получения и адресной доставки соответствующего генного продукта. После разработки методов идентификации и клонирования нормальных вариантов дефектных генов были предприняты попытки использовать их для коррекции генетических дефектов. Для лечения заболеваний на молекулярном уровне применяются два основных подхода: генная терапия ex vivo и генная терапия in vivo. При генной терапии ex vivo "терапевтический" ген переносят в изолированные клетки больного с помощью ретровирусных векторов или других систем доставки, трансдуцированные клетки культивируют и вводят пациенту. При этом у реципиента не развивается нежелательного иммунного ответа, но сама процедура является весьма дорогостоящей и трудоемкой. Альтернативный способ генной терапии ех vivo использует инженерную модификацию клеток, заключенных в мембрану, которая предотвращает развитие нежелательного ответа и не препятствует высвобождению "терапевтического" генного продукта. При генной терапии in vivo "терапевтический" ген вводят непосредственно в клетки ткани-мишени больного.

Весьма перспективным способом разрушения быстроделящихся раковых клеток представляется генная активация лекарственного вещества. В качестве лекарственных средств можно использовать не только генные продукты, но и олигонуклеотиды. С помощью так называемых "антисмысловых" олигонуклеотидов можно подавить полностью или частично экспрессию гена того или иного наследственного заболевания.

Методы

Физические методы

Ультрацентрифугирование (седиментационный анализ) — получило широкое распространение после изобретения в 1926 г. Т. Сведбергом аналитической ультрацентрифуги, с помощью которой он впервые определил молекулярную массу гемоглобина (68 кДа). В этом методе скорость седиментации (осаждения) определяется размером и формой разделяемых компонентов и выражается коэффициентом седиментации S.

В 40 — 50-е годы ХХ в. А. Клод и Ж. Браше разработали метод дифференциального центрифугирования для разделения органелл клетки, с помощью которого де Дюв (de Duve) в 1953 г. впервые выделил лизосомы, а затем — пероксисомы. В 1957 г. М. Месельсон, У. Сталь и Дж. Виноград разработали метод центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия для разделения нуклеиновых кислот, с помощью которого было установлено, что репликация ДНК осуществляется полуконсервативным путем. Различные варианты метода ультрацентрифугирования широко используют в молекулярно-биологических исследованиях для выделения внутриклеточных компонентов и макромолекул (нуклеиновых кислот и белков), а также определения их молекулярных масс и коэффициентов седиментации.

Хроматография — метод, впервые изобретенный русским ученым М.С. Цветом, который в 1906 г. фракционировал окрашенные экстракты листьев растений на колонках с порошком мела.

В настоящее время существует большое количество вариантов хроматографии, в которых используют матриксы (носители) разных типов, позволяющие разделить белки по заряду (ионообменная хроматография), размеру молекул (гель-хроматография, чаще называемая гель-фильтрацией) или способности специфически взаимодействовать с определенными химическими группами веществ, предварительно связанных с матриксом (аффинная хроматография). Из всех вариантов хроматографии наибольшей эффективностью обладает аффинная хроматография (хроматография по сродству), в основе которой лежит специфическое взаимодействие (узнавание) молекул взаимодействующих веществ.

Широкое распространение получила также высокоэффективная жидкостная хроматография. В этом методе используются специально разработанные кремнийорганические смолы, способные образовывать гомогенную среду в форме микросфер диаметром 3 — 10 мкм и позволяющие при высоком давлении осуществить быстрое равномерное протекание растворителя через колонку, при котором весь процесс хроматографии занимает считанные минуты и обеспечивает тонкое фракционирование смеси анализируемых молекул.

Электрофорез — в основе этого метода лежит способность белков, обладающих определенным суммарным положительным или отрицательным зарядом, перемещаться в электрическом поле в соответствии с величиной заряда, размером и формой молекул. Электрофорез можно проводить в водном (буферном) растворе, однако, как правило, его проводят в каком-либо пористом (полимерном) носителе: крахмальном, агарозном или полиакриламидном геле, на целлюлозных или нитроцеллюлозных пластинах и т.д.

Наиболее часто в настоящее время для разделения белков используют метод электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ), который представляет собой инертный матрикс с высоким и контролируемым числом поперечных сшивок. Варьируя размеры гелевых пор, можно фракционировать белки, существенно отличающиеся по молекулярной массе (от нескольких десятков тысяч до сотен тысяч дальтон). Метод был разработан в 1959 г. Дальнейшей модификацией этого метода стал электрофорез в ПААГ с додецилсульфатом натрия, предложенный в 1966 г. Дж. Майзелем. Додецилсульфат натрия (ДСН, SDS, ДС-Na) представляет собой мощный ионный детергент, который вызывает разворачивание белковых молекул в вытянутые цепи и сообщает им избыточный отрицательный заряд.

В начале 70-х годов ХХ в. в Швеции был разработан новый метод разделения белков в электрическом поле, получивший название изоэлектрофокусирования. В отличие от метода электрофореза, в процессе которого белки фракционируют при каком-то определенном значении рН, задаваемом электрофоретическим буферным раствором, при изоэлектрофокусировании белки разделяют в градиенте рН, создаваемом с помощью специальных реагентов (амфолинов). В процессе изоэлектрофокусирования белки передвигаются в электрическом поле в строгом соответствии только с зарядом молекул и останавливаются (фокусируются) в тех точках градиента рН, которые соответствуют их изоэлектрическим точкам (pI), т.е. там, где молекулы становятся электронейтральными.

Разработанное в 1975 г. П. Офареллом сочетание методов изоэлектрофокусирования и электрофореза в ПААГ с SDS получило название двумерного электрофореза.

В этой процедуре белки вначале обрабатывают β -меркаптоэтанолом и мочевиной, что приводит к их полному растворению, денатурации и диссоциации полипептидных цепей без изменения заряда. Далее проводят изоэлектрофокусирование в ПААГ, разделяя белки по заряду, а затем (в перпендикулярном направлении) ведут их электрофорез в блоке ПААГ с SDS, при котором белки разделяются по молекулярной массе. Таким образом, сочетая тонкое разделение вначале по заряду, а затем по размеру (массе), удается за один раз разделить до 2000 полипептидных цепей, т.е. проанализировать большинство всех белков бактериальной клетки.

Биологические методы

Культура клеток — этот метод берет начало с 1885 г., когда впервые было обнаружено, что клетки куриного эмбриона сохраняют жизнеспособность в солевом растворе. С 1907 г. стали использовать культуры фрагментов тканей (эксплантантов). В настоящее время используют диссоциированные культуры клеток, из которых можно получить клетки одного типа. Иногда в культуре клеток появляются мутанты, которые могут бесконечно размножаться и образовывать клеточную линию. В отличие от раковых клеток, также способных к непрерывному делению, мутантные клетки лучше растут в контакте с какой-то поверхностью.

Однородность клеточных линий можно повысить путем клонирования. Клон — это популяция клеток, происходящая от одной клетки-предшественницы. С помощью клонирования выделяют мутантные клеточные линии, у которых мутация затронула определенные гены. Такие клетки бывают нередко дефектны по какому-то определенному белку, что позволяет проанализировать его функцию в нормальных клетках.

Слиянием двух клеток могут быть получены гетерокарионы – клетки с двумя отдельными ядрами. После митотического деления гетерокарион превращается в гибридную клетку, у которой все хромосомы объединяются в одном ядре. Такие гибридные клетки дают возможность изучать функции отдельных хромосом, взаимодействие внутриклеточных компонентов (митохондрий, ядер и др.) различных клеток. Их можно клонировать и получить гибридную клеточную линию. Существенно, что гибридные клетки нестабильны. В частности, гибридные клетки человек-мышь постепенно утрачивают хромосомы человека, что позволяет судить о функциях отдельных хромосом, осуществляя таким образом их генетическое картирование.

Бесклеточные системы — незаменимы для изучения механизмов определенных молекулярных процессов, так как исключают различные побочные реакции, протекающие в клетке. В 1954 г. П. Замечник получил первую бесклеточную систему для изучения биосинтеза белка (трансляции). Возможности этих систем были далее блестяще использованы А.С. Спириным, М. Номурой и другими исследователями для изучения деталей трансляции. При этом из экстрактов клеток выделяли важнейшие компоненты белок - синтезирующей системы (мРНК, рибосомы, тРНК и др.), а затем последовательно вводили их в систему и уточняли роль каждого компонента в биосинтезе белка. С помощью бесклеточных систем был расшифрован генетический код, для чего в качестве мРНК использовали синтетические олиго- и полинуклеотиды известного состава.

Моноклональные антитела — очень чувствительный инструмент выявления (идентификации) молекул в сложных смесях, и поэтому они находят очень широкое применение в молекулярной биологии. Антитела в целом представляют собой белки (иммуноглобулины), вырабатываемые позвоночными животными для защиты от чужеродных соединений — антигенов. Клетки позвоночных животных способны синтезировать колоссальное количество (10⁸) различных форм антител, отличающихся участками узнавания антигенов. Именно высокая специфичность антител определяет их уникальные возможности для выявления различных молекул в клетке. Разработанный в 1976 г. метод включает клонирование В-лимфоцитов, секретирующих только определенный вид антител, благодаря чему эти антитела можно получать в больших количествах. Но время жизни В-лимфоцитов в культуре невелико, поэтому проводят их слияние с клетками, происходящими от «бессмертной» опухоли, также полученной из В-лимфоцитов. Из образовавшейся смеси клеток отбирают гибриды, способные развиваться в культуре и синтезировать антитела определенного вида. Эти гибридные клетки называют гибридомами. Их клонируют по отдельности и получают клоны, каждый из которых является источником моноклональных антител. Моноклональные антитела происходят от одной-единственной клетки и обладают абсолютной специфичностью к белкам: они способны узнавать определенную конфигурацию группы из 5 — 6 аминокислотных остатков. Каждый тип антител можно далее использовать в качестве зонда для определения локализации белка в клетке и для очистки белков в аффинной хроматографии. В недалеком будущем моноклональные антитела могут стать источником для создания новой группы каталитически активных молекул — абзимов.

Каталитически активные белки (ферменты) — важнейшие инструменты биохимических методов исследования. Они нашли широкое применение в молекулярной биологии, и конкретные примеры их использования будут приведены в последующих главах.

Дата добавления: 2015-12-01