Как работают молочнокислые микроорганизмы

Полянская И.С., Топал О.И., Семенихина В.Ф.

«В числе полезных бактерий почётное место надо предоставить молочнокислым бациллам. Они вырабатывают молочную кислоту и таким образом мешают развитию масляных и гнилостных ферментов, которые мы должны считать в числе самых страшных наших врагов…» И.И. Мечников, 1907 г.

Ключевые слова: молочнокислые микроорганизмы, лактобациллы, патогенные и условно-патогенные микроорганизмы ПиУПМ, антибиотическая активность, функциональные продукты питания ФПП

Антибиотическая активность, как составляющая часть пробиотического эффекта культур лактобацилл, может быть связана с выработкой ими кислот, в первую очередь, молочной, перекиси водорода, бактериоцинами и др. Насколько часто антибиотическая активность молочнокислых микроорганизмов - лактобацилл (в частности, болгарской и ацидофильной палочек) связана с различными механизмами антибиотической активности – задача настоящего исследования.

Молочнокислые микроорганизмы, применяемые для производства всех без исключения ферментированных молочных продуктов (кисломолочных напитков, сметаны, ложковых йогуртов, творога, сыров и др. продуктов, производимых с использованием закваски) осуществляют преобразования основных компонентов молока во вкусовые, ароматические, биологически активные вещества, не только участвуя в формировании консистенции продукта, но и подавляя размножение опасных для потребителей микроорганизмов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (далее ПиУПМ) как во время технологического процесса, так и желудочно-кишечном тракте ЖКТ, в случае их жизнеспособности там (аллохтонности).

Среди типичных продуктов жизнедеятельности (метаболитов) молочнокислых микроорганизмов и бифидобактерий: молочная, уксусная, муравьиная и янтарная кислоты, аминокислоты и белки, витамины В1, В2, К, никотиновая, пантотеновая и фолиевая кислоты, пиридоксин, цианкобаламин и др. биологически активные вещества [1]. Кроме того, механизмами антибиотической активности могут быть: выработка диацетила, перекиси водорода, лизоцима, и бактериоцинов.

Именно с бактериоцинами в последнее десятилетие связывают большие надежды [2], т.к. они (в отличие от антибиотиков, которые действуют на мишени клеточной стенки бактерий и часто приводят к образованию антибиотикоустойчивых штаммов) образно выражаясь, «расстреливают» ПиУПМ, не оставляя шанса им выжить.

Лактобациллы (в частности болгарская Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus и ацидлфильная Lactobacillus acidophilus палочки), в одной стороны являются аллохтонной микрофлорой, с другой стороны, широко используются для производства как традиционных ферментированных молочных продуктов, так и инновационных ФПП. Нельзя не упомянуть ещё одну важнейшую функцию лактобацилл. Наряду с бифидобактериями они способны обеспечивают устойчивость иммунной системы микроорганизма к инфекционным заболеваниям, являются естественными биосорбентами, обезвреживающими значительное количество соединений тяжелых металлов, фенолы, формальдегиды и др. токсичные вещества, попадающие в организм хозяина из окружающей среды и влияющие на снижение иммунитета [1, 2].

Не вызывает сомнения, что основной механизм подавления патогенных микроорганизмов лактобациллами, известный еще И.И. Мечникову, выработка кислот, в первую очередь молочной, или2-гидроксипропановой кислоты — С₂Н₄(ОН)—СООН. Поэтому для представленных исследований антибиотической активности нами использовалась модифицированная методика [3] – сравнения зон антибиотической активности на разной степени забуференных фосфатным буфером питательных средах.

Стандартный фосфатный буфер имеет состав: КH₂PO₄ (0,2 моль/л, или 13,6 г/л) + Na₂HPO₄ (0,2 моля/л, или 31,2 г/л). Гидрофосфат-анион – боле слабый (Кд=6,2 ^. 10^-8), чем молочная кислота (Кд=1,4 ^. 10^-4). Добавленная к фосфатному буферу одноосновная молочная кислота провзаимодействует с солевой компонентой системы и заместится на эквивалентное количество компоненты, играющей роль слабой кислоты (Кд=5,0 ^. 10^-13).

К₂HPO₄ + С₃Н₆О₃ = КH₂PO₄ + КС₂Н₄(ОН)—СОО - молекулярное уравнение (1)

X= 48 г		32 г
HPO4^2-	+	H^+	=	H2PO4^-	- сокращенное ионное уравнение (2)
136 г /моль		90 г /моль

Известно, что количество молочной кислоты, продуцируемое лактобациллами достигает 32 г/л, или (т.к. молярная масса молочной кислоты 90 г/моль) около 0,36 моль/л ионов H⁺. По закону эквивалента из уравнения 2 следует, чтобы фосфатный буфер нейтрализовал указанное количество молочной кислоты, необходимое его содержание в питательной среде для молочнокислых микроорганизмов также примерно 0,36 моль, или 62 г/л.

Особенности накопления молочной кислоты в условиях плотной питательной среды MRS, на которой поводились исследования антибиотической активности по сравнению с жидкой питательной средой (молочной смесью), и приведенные расчеты, показывающие недостаточность использования стандартного содержания буфера для эквивалентного связывания всей молочной кислоты, явились обоснованием необходимости использования на различной степени забуференности среды:

1) со стандартной буферизацией 1 мл. стандартного фосфатного буфера (1Б) на 19 мл среды MRS.

2) с трехкратной буферизацией 1 мл. фосфатного буфера (0.33Б) на 19 мл среды MRS.

Антибиотическую активность определяли чашечным методом перпендикулярных штрихов. На питательном агаре MRS (без буфера и с буфером) высевали в виде штриха культуру лактобациллы, культивировали 1 сутки при температуре, оптимальной для каждого конкретного вида штамма. Затем перпендикулярно ему делали штриховые посевы различных тест-микробов и помещали чашки на 24 ч. в термостат при 37 ◦С. Действие антагонизма на штаммы тест-культур характеризовали зоной задержки их роста от штриха антагониста, называемой зоной антибиотической активности, измеряемой в мм (рис. 1).

На данном этапе сравнительной антибиотической активности на среде без буфера и забуференных средах исследовано культур Lactobacillus acidophilus – 18, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus – 8, культуры из коллекций ВНИИМИ (г. Москва) и ФГУП «Экспериментальной биофабрики» (г.Углич).

В качестве тест-культур использовали 10 штаммов ПиУПМ. В опытах использовались: Staphylococcus, Рroteus, Salmonella, E. сoli, выделенных и идентифицированных до подвида во ВНИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко и листерий Listeria, переданных для исследований ВНИИМИ.

По результатам исследований, в данной выборке культур Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus проявляют сравнительно более высокую антагонистическую активность, которая резко падает при увеличении степени буферизации среды и отсутствует при эквивалентном количестве буфера, поэтому является во всех случаях, преимущественно, кислотной. Культуры Lactobacillus acidophilus чаще, а именно в 4 случаях из 18, что составляет 22,2%, обладают смешанным механизмом антагонизма.

Таблица 1. – Средняя зона антибиотической активности культур со смешанным типом антибиотической активности

Культура лактобацилл	Средняя зона антибиотической активности, мм на питательной среде
MRS	MRS, 1Б	MRS, 0.33Б
Lactobacillus acidophilus 22т вяз	17,9	16,0	10,4
Lactobacillus acidophilus 9с	18,9	17,6	9,3
Lactobacillus acidophilus ац. слиз	18,0	17,8	8,7
Lactobacillus acidophilus 18	20,2	17,5	9,1

Среди культур Lactobacillus acidophilus выявлено 4 штамма (табл. 1), которые, при некотором снижении антибиотической активности с увеличением степени буферизации среды, сохраняют антагонизм (зоны подавления до 10, в отдельных случаях 20 мм), что позволяет предположить проявление дополнительного механизма антибиотической активности (к подавлению кислотами).

Это культуры:

6. Lactobacillus acidophilus 22т вяз, биофабрика, Углич

13. Lactobacillus acidophilus 9с, ВНИИМИ

14. Lactobacillus acidophilus ац. слиз, ВНИИМИ

19. Lactobacillus acidophilus 18, ВНИИМИ

А) Lactobacillus acidophilus 22т вяз	Б) Lactobacillus acidophilus 9с	В) Lactobacillus acidophilus ац. слиз	Г) Lactobacillus acidophilus 18
Рис. 1 Антибиотическая активность культур на среде MRS (слева) и MRS, 0.33С (справа)

Для сравнения приводим типичное фото по культуре (2. Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus 272, биофабрика, Углич), антибиотическая активность которой связана исключительно с образованием кислот (рис. 2)

Рис. 2 Антибиотическая активность культуры Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus 272на среде MRS (слева) и MRS, 0.33С (справа)

Как уже указывалось, нельзя исключать, что кроме органических кислот и бактериоцинов механизмами антибиотической активности могут быть также выработка диацетила, перекиси водорода, лизоцима. Поэтому необходим дополнительный этап по проведению устранения (выявления) указанных возможных механизмов, прежде чем приступить к поиску собственно бактериоцинов производственно-ценных культур с высокой антибиотической активностью.

Литература

1. Гастроэнтерология. Режим доступа: http://www.medicinform.net/gastro/gastro_pop22.htm, свободный.

2. Джессика Снайдер Сакс. Микробы хорошие и плохие. Наше здоровье и выживание в мире бактерий. – М.: Элемент, 2013. - 153 с.

3. И.С. Полянская, Семенихина В.Ф. Антибиотическая активность молочнокислых бактерий к стафилококкам. – Молочная промышленность, №7. – 2014 г.

Дата добавления: 2015-09-04