На рис. 14 представлена схема получения флуоресцирующей сыворотки.
| Подготовка антигенов | Подготовка кроликов |
| Гипериммунизация кроликов |
| Тотальное взятие крови |
| Получение сыворотки |
| Высаливание глобулинов сульфатом аммония |
| Очистка глобулинов от сульфата аммония |
 Мечение глобулинов флуоресцеин изотиоцианатом (ФИТЦ)
|
| Удаление избытка флуорохрома |
| Консервирование препарата |
| Расфасовка, лиофильная сушка |
| Упаковка, маркировка, контроль |
Рис. 14. Технология приготовления флуоресцирующих сывороток
Кроликов иммунизируют многократно инактивированными антигенами и получают сыворотку крови с титром антител не ниже 1:6400-1:12800. Из сыворотки осаждают глобулины сульфатом аммония. Очищенный глобулин метят ФИТЦ. Меченые глобулины консервируют мертиолятом, разливают в ампулы, лиофилизируют и проводят контроль качества.
Флуоресцирующие сыворотки (глобулины) проверяют на активность (красящий титр) и на специфичность.
Их используют для экспресс-диагностики инфекционных болезней в реакции иммунофлуоресценции (РИФ) – метод флуоресцирующих антител(МФА).
Учет результатов реакции осуществляется с помощью люминесцентного микроскопа, в оптическую систему которого устанавливается набор светофильтров, обеспечивающих освещение препарата ультрафиолетовым или сине-фиолетовым светом с заданной длинной волны. Это заставляет флюорохром светиться в заданном диапазоне спектра. Исследователь оценивает характер свечения, форму, размер объектов и их взаимное расположение.
Разработаны прямой и непрямой варианты РИФ.
Метод прямой РИФ — антиген связывается с антителом, конъюгированным с флуоресцентной меткой (рис. 15).
Рис. 15. Прямая реакция иммунофлуоресценции
Чаще всего РИФ используют для быстрого обнаружения возбудителя в патологическом материале. В этом случае из исследуемого материала готовят мазок на предметном стекле, как для обычной микроскопии. Препарат фиксируют спиртом, ацетоном или другим химическим фиксатором, иногда входящим в состав диагностического набора.
На поверхность фиксированного мазка наносят меченные ФИТЦ сыворотки (в случае непрямой РИФ, сначала препарат обрабатывают сывороткой против искомого антигена, а затем меченными антителами к иммуноглобулинам, использованным на первом этапе). Поскольку РИФ является разновидностью гетерогенного анализа, один этап отделяется от другого промывкой.
Метод непрямой иммунофлуоресценции - антиген связывается с неконъюгированным специфическим антителом (первичным антителом). Флуоресцентная метка конъюгирована со вторичным антителом, специфичным к первичному антителу.
Образуется комплекс «антиген-антитело-антитело» (рис. 16).
Рис. 16. Непрямая реакция иммунофлуоресценции
Если прямая РИФ может использоваться только для обнаружения антигена, то непрямой вариант этой реакции может быть использован как для обнаружения антигена, так и для обнаружения антител в сыворотке крови больного животного.
В этом случае готовят мазки из эталонного штамма возбудителя. Исследуемую сыворотку наносят на мазок. Если в ней присутствуют искомые антитела, то они связываются с антигенами микробных клеток. Промывка препарата буферным раствором позволяет удалить несвязавшиеся антитела. Затем препарат обрабатывают меченной сывороткой против специфических антител (анти-антитела). В случае положительного результата реакции при микроскопии мазка в люминесцентном микроскопе наблюдают специфическое свечение комплекса «антиген-антитело-антитело».
Дата добавления: 2015-08-27; просмотров: 322 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая страница | | | следующая страница ==> |
| Приготовление и применение флуоресцирующих сывороток | | | Моноклональные антитела и их получение |