Рис. 9. Рост культуры M.bovis на яичной питательной среде
На протяжении всего периода изучения туберкулеза значительный массив научных исследований был посвящен усовершенствованию питательных сред для выделения и выращивания микобактерий.
Частота выделения микобактерий из биоматериала, так же как из проб, взятых из объектов внешней среды, зависит от двух факторов: способа предпосевной обработки исследуемого материала и качества питательной среды, используемых для посевов. Предпосевная обработка исследуемого материала основана на том, что ввиду строения клеточной оболочки микобактерий устойчивы к воздействию кислот, щелочей, спиртов и многих других антибактериальных веществ, которые губительно действуют на банальную (сопутствующую) микрофлору, и частично оказывают негативное влияние на микобактерии. В практике бактериологических лабораторий в этих целях используют растворы щавелевой (метод Гона – Левенштейна – Сумоши), серной (метод А.П. Аликаевой) кислот, едкого натра (метод флотации О.В. Мартма) хлоргексидина биглюконикума и др. К недостаткам вышеперечисленных методов следует отнести, губительное в некоторой степени действие кислот и щелочей на микобактерии, в результате чего уменьшается число жизнеспособных клеток, соответственно снижается эффективность их выделения из исследуемого материала [23]. Рядом авторов установлено, что обработка биологического материала 1% раствором этония в течении 30 мин. имеет ряд преимуществ перед другими способами, используемыми в целях предпосевной подготовки биоматериала, обеспечивает повышение выделения культур и сокращение сроков постановки диагноза.
Выбор питательных сред для культивирования МБТ и накопления бактериальной массы основывался на химическом составе микроорганизма, исходя из того, что МБТ для своего роста и размножения нуждаются в источниках углерода, азота и минеральных веществ.
Главным источником углерода для МБТ является глицерин, наилучшим источником азота – аммонийные соединения (аспарагин). Для питания МТБ необходимы ионы магния, калия, железа, серы, фосфатионы.
Все указанные ингредиенты применяются для конструирования плотных и жидких питательных сред.
Для первичной генерации микобактерий пригодны кровяной агар, жидкая среда Сотона, плотные яичные питательные среды Левенштейна-Йенсена, а также среды Гельберга, Финн-2, Петраньяни, Мордовской, а для поддержания культур – картофельная среда А. Д. Павловского. В литературе описано также использование для выделения и накопления микобактерий туберкулеза среды Middlebrook в разных модификациях, среды Stonebrink, которая отличается от среды Левенштейна-Йенсена тем, что глицерин заменен на 0,5% пирувата натрия. В качестве селективной для получения культуры M. tuberculosis предложена среда Stonebrink, которая содержит полимиксин, амфотерицин, карбенициллин и триметоприм (TB Medium with PACT) [75].
Существует также «транспортная среда для возбудителя туберкулёза» (Сафонова, Аникин, Голышевская, 1993) [30] предназначенная для сохранения и потенциирования жизнеспособности возбудителя туберкулёза при длительном хранении и транспортировке. Среда дополнительно содержит калий янтарнокислый, нуклеиновую кислоту, калий гетероауксин. Применение этой среды по данным авторов сокращает затраты времени на одну манипуляцию посева.
Для накопления бактериальной массы применяются синтетические жидкие питательные среды Сотона и Курской биологической фабрики. В обе эти среды в качестве азотосодержащего вещества входит аспарагин. Ф. И. Осташко (1954) [24] в составе среды заменил аспарагин на яблочную кислоту и получил среду с высокими элективными свойствами. А. А. Евглевским (1968) [15] были разработаны и апробированы две синтетические питательные среды: одна с лимонной кислотой без аспарагина и вторая с лимонной кислотой, аспарагином и сернокислым цинком под названием «среда Курской биологической фабрики». Эти среды выгодно отличались от предыдущих аналогов увеличением накопления бактериальной массы в 3 раза и перспективой широкого использования не только в жидком состоянии, но и в качестве минеральной основы для агаризованной среды, а также для централизованного обеспечения лабораторных учреждений путем выпуска её в концентрированном состоянии.
Попытки повысить ростовые качества среды были предприняты Н. Н. Исамовым и Э. У. Умеровым (1986) [20]. Ими для накопления биомассы микобактерий в состав среды дополнительно внесли DL-метионин, а в качестве соли натрия – натрий лимоннокислый. Кроме этого среда содержала калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный, магнезию сернокислую, железо лимоннокислое аммиачное, L-аспарагин, глицерин, 10 % раствор твина – 80,5 % водный раствор сывороточного бычьего альбумина, соль натрия и дистиллированную воду.
Т. Т. Попеску [27] с целью повышения выхода биомассы включил в состав среды натрий гидроцитрат пятиводный, а соли железа заменил на железоаммиачные квасцы и в качестве стимулятора роста добавил 2-аминоглютаровую кислоту. В состав питательной среды для культивирования микобактерий входили: магний сернокислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий лимоннокислый, соль железа. С помощью этой среды автору удалось повысить выход бактериальной массы штамма БЦЖ до 198 мг и эпизоотического штамма – до 218 мг (сухого вещества).
Е. А. Асташовой с соавт. [3] была предложена полужидкая питательная среда для накопления и идентификации бактериальных и L‑форм микобактерий. В её состав входят: L-аспарагин, лимоннокислый натрий, сернокислый магний, лимоннокислое аммиачное железо, фосфорнокислый однозамещенный калий, фосфорнокислый двузамещенный натрий, глицерин, индикатор бромтимоловый синий, сыворотка крови крупного рогатого скота.
Учеными ЦНИИТ и Казахского НИВИ разработана питательная среда для получения сферопластов микобактерий туберкулёза. Она содержит: фосфорнокислый двузамещенный натрий, сернокислый магний, сахарозу, дистиллированную воду а также 20 % раствора хлоргексидина глюконата в качестве лизирующего агента, что обеспечивает ускорение получения сферопластов при сохранении продуктивности среды [14]. Недостатком вышеперечисленных сред является длительный период накопления биомассы и низкий её выход – 7,0–9,0±1,0 г/дм3.
Позднее А. А. Евглевский (1999) [16] предложил синтетическую питательную среду с элективными свойствами, позволяющими достичь выхода бактериальной массы до 13,0 г/дм3 за 55 суток культивирования. Концентрат этой среды включает органическую кислоту, соль органической кислоты аммония, сернокислые железо и магний, глицерин и двузамещенный фосфорнокислый калий.
В качестве источника органической кислоты автором предложена лимонная кислота, а в качестве соли органической кислоты – аммония цитрат, сернокислый цинк и аспарагин. Концентрат растворяется дистиллированной водой и рН доводится до 7,5±0,5. Эта среда, по данным автора, позволяет получить выход биомассы до 12,8±0,1 г/дм3.
В процессе дальнейшего усовершенствования синтетической питательной среды с целью повышения выхода целевого продукта – культуры микобактерий, нами в состав существующей среды с гликоколом были добавлены сернокислый цинк и лимонная кислота, что дало возможность повысить выход бактериальной массы до 13,6±0,2 г/дм3. В состав этой среды входили мас.%: гликокол – 6,0±2,0; лимонная кислота – 4,0±1,0; аммоний лимоннокислый – 3,0±1,0; кальций фосфорнокислый двузамещённый – 5,0±0,5; магний сернокислый семиводный – 0,5±0,1; цинк сернокислый – 0,2±0,05; железо лимоннокислое аммиачное – 0,05±0,001; глицерин – до 50,0±5,0 и вода дистиллированная до 1000,0.
Технология приготовления не отличалась по степени сложности от предыдущей среды, но давала возможность не только увеличить выход биомассы, но и сократить сроки культивирования до 50–55 суток.
Представленная разработка даёт возможность не только ускорить процесс получения большого количества бактериальной массы, но и способствует усовершенствованию получения аллергенов и протеинов на более перспективных питательных средах.
Нами, с целью быстрого накопления биомассы и получения ещё более высокого уровня выхода бактериальной массы, была разработана синтетическая питательная среда для выращивания микобактерий. В её состав входят в качестве источника соли органической кислоты – лимоннокислый аммоний, отличающаяся от вышеперечисленных образцов сред тем, что аспарагин в ней был заменен на гликокол.
Для оптимального роста и накопления бактериальной массы нами было сконструировано три варианта среды, куда входили следующие ингредиенты в количественном соотношении мас.%:
1. Гликокол – 5,0, аммоний лимоннокислый – 3,0, калий фосфорнокислый двузамещенный – 4,5, магний сернокислый семиводный – 3,0, железо лимоннокислое аммиачное – 0,05, глицерин – 50,0, воды дистиллированной – до 930,0 (минимальная).
2. Гликокол – 5,5, аммоний лимоннокислый – 3,5, калий фосфорнокислый двузамещенный – 4,5, магний сернокислый семиводный – 3,5, железо лимоннокислое аммиачное – 0,05, глицерин – 55,0, воды дистиллированной – до 920,0 (оптимальный).
3. Гликокол – 6,0, аммоний лимоннокислый – 4,0, калий фосфорнокислый двузамещенный – 5,0, магний сернокислый семиводный – 4,0, железо лимоннокислое аммиачное – 0,06, глицерин – 60,0, воды дистиллированной – до 920,0 (максимальная).
Во всех вариантах рН доводили до 7,2±0,2. Кроме этого нами было приготовлено дополнительно шесть вариантов питательных сред, отличающихся рН от вышеперечисленных образцов. В первом варианте рН равнялась 6,3, втором – 6,5, третьем – 6,8, четвертом – 7,0, пятом – 7,2 и шестом – 7,5.
Все девять вариантов питательных сред готовили таким образом. Навески железа лимоннокислого аммиачного растворяли в горячей дистиллированной воде на пламени горелки. Навески других солей растворяли в теплой дистиллированной воде в указанной выше последовательности. После этого добавляли глицерин и тщательно перемешивали в колбе до полного растворения солей. Полученные солевые растворы подщелачивали в первых трёх вариантах до 7,2, а в остальных до указанных выше величин рН и подвергали стерилизации путём автоклавирования при температуре 120°С в течение 30 минут. Солевые растворы хранили при температуре 4°С.
Изучение ростовых свойств приготовленных питательных сред проводили путём высева культуральной плёнки референтных штаммов Vallae, БЦЖ и эпизоотического «Крушинский» на 10 флаконах каждого варианта среды. В качестве контроля служила питательная среда Сотона.
Посевы на опытных и контрольных средах помещали в термостат при температуре 37±0,5°С.
Учёт роста культур на опытных и контрольных средах проводили через каждые 3–7 суток в течение 55 и 60 суток.
В результате сравнительного изучения ростовых свойств приготовленных образцов питательных сред установлено, что поверхность жидкой питательной среды на 7 (оптимально) и 12 (максимально) сутки после посева референтных штаммов покрывалась культуральной шероховатой плёнкой.
На контрольной среде Сотона только на 10 сутки роста культуральная пленка (Vallae и эпизоотического штамма) покрывала 1/3 часть поверхности питательной среды, а уже на 12 сутки роста на среде с гликоколом вся поверхность жидкой питательной среды была покрыта культуральной пленкой.
Также было изучено влияние рН среды на её ростовые качества. На среде с рН=6,5 рост всех трёх культур микобактерий, взятых для данного опыта (Vallae, БЦЖ, «Крушинский»), появился через 7 суток в виде шероховатой плёнки, занимающей 1/3 часть поверхности питательной среды. При рН=6,8 за тот же промежуток времени до аналогичного показателя вырос только штамм Vallae.
Через 55 и 60 суток после посева культур микобактерий по 5 флаконов каждого варианта синтетической питательной среды было подвергнуто термической обработке. После отделения бактериальной массы от культурального фильтрата, определяли выход бактериальной массы, предварительно высушив её в термостате.
Сведения о выходе бактериальной массы на предлагаемой питательной среде с рН=6,5 в сравнении со средой Сотона приведены в табл. 1. Из неё видно, что самыми высокими ростовыми качествами обладает среда с гликоколом в следующих соотношениях компонентов мас.%: гликокола – 5,5, аммония лимоннокислого – 3,5, калия фосфорнокислого двузамещенного – 4,5, магния сернокислого семиводного – 3,5, железа лимоннокислого аммиачного – 0,05, глицерина – 55,0 с с рН=6,5, которая давала выход бактериальной массы до 13,0±0,1 г/дм3 сухого вещества, что в 1,3 раза больше, чем в прототипе (среда Сотона), где выход биомассы составил 9,2 г/дм3.
Для сравнения нужно отметить, что известные жидкие питательные среды Курской биологической фабрики (Евглевский, 1968) [15] с лимонной кислотой без аспарагина и с лимонной кислотой, аспарагином и сернокислым цинком, характеризуются достаточно высокими элективными свойствами и дают выход бактериальной массы до 10,0±1,0 г/дм3.
Таблица 1. Выход бактериальной массы на жидкой питательной средедля выращивания микобактерий с гликоколом
Штамм микобактерий | Количество бактериальной массы, г/дм3 (сухого вещества) | |||
Среда при содержании мас.% | Среда Сотона (контроль) | |||
Минимальная | Оптимальная | Максимальная | ||
Vallae | 11,9 | 13,1 | 12,8 | 8,9 |
«Крушинский» | 12,2 | 13,0 | 12,9 | 9,2 |
БЦЖ | 11,6 | 13,0 | 12,6 | 7,0 |
Полученные результаты по увеличению ростовых качеств питательной среды за счёт сдвига рН в кислую сторону к рН=6,5 А.А. Ткаченко (2000) [33] связывает с тем, что естественная среда для размножения микобактерий туберкулёза в лимфатических узлах макроорганизма имеет именно такой уровень рН. Интересным является установленный этим же исследователем факт повышения патогенности исходно авирулентных штаммов микобактерий после культивировании на среде с рН 7,0-7,2 в течении 100 последовательных пассажей они вызывали характерные туберкулезные изменения у лабораторных животных, тогда как при пассажировании на среде с рН 6,5 такого явления не наблюдалось [34]. В литературе есть мнение, что более шелочная среда способствует сохранению вирулентности микобактерий и корд-фактора [17, 34]
Коллектив исследователей под руководством А.С. Донченко для культивирования микобактерий туберкулеза предложили усовершенствованный мясопептонный агаровый гель, отличающийся тем, что он дополнительно содержит глюкозу и глицерин (на 100 г мясопептонного агарового геля 1,0-1,2 г и.2,0-2,2 г компонентов соответственно) [13].
Эти же авторы предложили добавлять в плотную среду вытяжку древесной золы и оксидат торфа при следующем соотношении компонентов: яйца куриные, 4-5 шт, 2%-ный водный раствор малахитовой зелени, - 3,33 мл, 41,5%-ная вытяжка древесной золы, – 100 мл, глицерин, - 1,6-2,5 мл, оксидат торфа – 0,1 мл. Среда позволяет ускорить рост микобактерий как в чистой культуре, так и из биоматериала, что сокращает сроки постановки диагноза на туберкулез и повышает точность бактериологической диагностики заболевания [12].
Вытяжка древесной золы была использована и при разработке усовершенствованной жидкой среды для культивирования микобактерий туберкулеза на основе среды Сотона. Среда содержити аспарагин, глицерин, а минерально-солевую основу данной среды составляют такие компоненты, как лимонная кислота, калий фосфорнокислый двуосновной, магний сернокислый, цитрат аммиачного железа. Техническая задача улучшения ростовых свойств среды и сокращения сроков выращивания патогенных микобактерий туберкулеза была решена путем дополнительного введения криалла и сыворотки крови лошадей, а в качестве минерально-солевой основы была предложена вытяжка древесной золы при следующем соотношении компонентов: 1,5%-ная вытяжка древесной золы, глицерин – 6,0 г, аспарагин – 0,4 г; криалл– 1,0-1,2 г, сыворотка крови лошади –1,0-1,2 г. [11]. Авторы указывают, что положительное биологическое действие вытяжки древесной золы обусловлено содержанием в ней необходимых для питания микобактерий туберкулеза микроэлементов: серы, магния, железа, цинка, калия и фосфора, установленное путем проведения спектрального анализа.
Растительные компоненты были также были включены В.Г. Ощепковым и соавт. (2010) [25] в состав еще одной модифицированнной питательной среды для культивирования микобактерий туберкулеза: в состав среды Левенштейна- Йенсена в качестве стимулятора роста был введен 10%-й экстракт полыни. При этом экстракт полыни наслаивается на поверхность готовой среды в дозе 0,2-0,3 мл/на пробирку. Использование изобретения позволяет сократить сроки культивирования и повысить выделяемость культур микобактерий из биоматериалов на 8-10% за счет выявления микобактерий с измененными морфологическими, культуральными свойствами и ослабленной жизнеспособностью. Такой биологический эффект экстракта полыньи обуславливается содержанием в нем широкого набора биологически активных соединений: каучука, фенолкарболовых кислот и их производных, эфирного масла и др., которые в определенной дозе обладают стимулирующим действием на рост микроорганизмов.
В мировой медицинской практике для первичной изоляции микобактерий часто используется среда Middlebrook в разных модификациях. Middlebrook разработали ряд рецептур, содержащих олеиновую кислоту и альбумин в качестве основных ингредиентов для обеспечения роста туберкулезных бацилл и защиты микроорганизмов от ряда токсических агентов, в частности основную рецептуру бульона 7H9 одновременно с созданием базового агара. Среды обоих типов поддерживают рост видов микобактерий при наличии добавок питательных веществ, таких как глицерин, олеиновая кислота, альбумин и декстроза, за исключением M. bovis, рост которых ингибируется глицерином [72; 73].
Эти среды используются в приготовлении культур для определения противомикробной активности, в качестве минимальной среды для биохимических тестов, а также для получения субкультур исходных штаммов.
Миддлбрук и Кон (Cohn) [68] усовершенствовали рецептуру агара с олеиновой кислотой и альбумином и добились более быстрого и интенсивного роста видов Mycobacterium в среде, получившей обозначение 7H10. Сообщалось, что в среде 7H10 наблюдается рост меньшего количества микроорганизмов-загрязнителей, чем в среде на яичной основе, обычно используемой для культивирования микобактерий. В агаре BD Middlebrook 7H10 содержатся различные неорганические соли, которые служат веществами, необходимыми для роста микобактерий. Так, натрия цитрат, превращаясь в лимонную кислоту, служит для удержания определенных неорганических катионов в растворе. Глицерин является богатым источником углерода и энергии. Олеиновая кислота, как и другие жирные кислоты с длинной углеродной цепочкой, может использоваться туберкулезными бациллами и играет важную роль в метаболизме микобактерий. Каталаза разрушает токсичные пероксиды, которые могут присутствовать в среде. Основной эффект альбумина заключается в защите туберкулезных бацилл от токсических агентов, что позволяет повысить степень их выделения при первичной изоляции. Частичное ингибирование загрязняющих бактерий достигается благодаря присутствию красителя малахитового зеленого [19; 68; 72; 75].
Добавив один грамм панкреатического гидролизата казеина на литр в рецептуру агара 7H10, для улучшения роста штаммов Mycobacterium tuberculosis, для которых наблюдался слабый рост (или рост вообще отсутствовал), на 7H10 и других обычных изоляционных средах. Эта рецептура получила название агар 7H11[47; 73].
При сопоставлении ростовых свойств агара 7H11, кровяного агара (B83), а также яичной среди Stonebrink’s (SB). [58] было установлено, что минимальное время появления колоний М.bovis при применении сред 7H11 и B83 составило 28 дней, а среды SB – 36 дней, в то же время последняя из них обеспечивала выявление большего числа положительных проб.
Для усиления роста микобактерий предложено ряд добавок ADC, OADC, (FD018), ростовая добавка к среде VersaTREK Myco GS. В состав добавок в основном входят натрия хлорид, альбумин бычий (фракция 5), глюкоза, каталаза, кислота олеиновая, полиоксиэтилена стеарат. Олеиновая кислота и другие высокомолекулярные жирные кислоты составляют неотъемлемую часть метаболизма микобактерий, глюкоза используется как источник энергии. Каталаза нейтрализует токсичные перекиси, альбумин предохраняет туберкулезные бациллы от воздействия других токсичных агентов.
Важное значение для диагностики туберкулеза имеет выделение L-форм микобактерий туберкулеза. При этом требуется полужидкая питательная среда, обеспечивающая необходимые для их роста осмотические условия. Наиболее известной является полужидкая среда в модификации Дорожковой для выращивания L-форм микобактерий туберкулеза, содержащая: источник азота, сахарозу, нативную сыворотку крови крупного рогатого скота или лошади, лимоннокислый натрий, лимоннокислое аммиачное железо, калий фосфорнокислый, двухзамещенный натрий, магний сернокислый, глицерин, агар-агар и воду [14]. Однако эта среда не позволяет получить в лабораторных условиях экспериментальные L-культуры микобактерий, необходимые для опытов по изучению особенностей вызываемого ими инфекционного процесса. Кроме этого она не обеспечивает быстрого роста L-форм микобактерий туберкулеза и достаточного накопления биомассы, а присутствие примесей в солевой основе оказывают токсическое влияние на клетку.
Ощепков В.Г. и соавт (2004) [26] усовершенствовали ее путем дополнительного введения предельного углеводорода с длиной цепи С14-С17, изониазида, при этом солевая основа представлена буферным раствором Хенкса. Авторы указывают, что сокращение сроков роста и повышение выхода биомассы L-форм микобактерий, достигается тем, что стандартный раствор Хенкса не содержит токсичных ионов, создает необходимую буферность и играет существенную роль в обмене веществ микобактериальной клетки. Для приготовления среды пользуются предварительно очищенными реактивами и деионизированной водой. Предельные углеводороды с длиной цепи C14-C17 в дозе 0,1-0,2 мл на пробирку оказывают ростостимулирующее влияние, активно воздействуют на обменные процессы в микробной клетке, активизируют синтез углеводов, являются источником энергии и пластическим материалом Также было доказано, что понижение дозы не оказывает ростостимулирующего влияния, а повышение дозы приводит к снижению скорости роста, поэтому это количество (0,1-0,2 мл) является оптимальным для достижения эффекта.
В качестве L-трансформирующего агента питательная среда содержит изониазид, который влияет на белковый синтез микобактериальной клетки, в результате чего происходит нарушение целостности клеточной стенки бактерий и образование L-форм. Патогенные микобактерии являются биохимически менее активными, о чем свидетельствует их медленное размножение и потребность в определенном комплексе питательных веществ. Они содержат меньше энзимов и ростовых веществ, поэтому являются более чувствительными к антибактериальным препаратам.
Также необходимо наличие в среде нативной сыворотки крови крупного рогатого скота или лошади. Она обладает буферными свойствами, а также оказывает стимулирующее влияние на размножение и рост L-форм, так как с сывороткой крови в среду поступают белки и ряд прочно связанных с ними витаминов. Использование предлагаемой питательной среды позволяет ускорить рост L-форм в 2-3 раза, повысить интенсивность накопления биомассы в 2 раза.
Антигенные свойства углеводсодержащих фракций, выделяемых из микобактерий
Большое число различных белков, синтезируемых микобактериальной клеткиой классифицированы и изучены в составе групп с некоторыми общими свойствами, (физические и химические, функция и локализация в микобактериальной клетке). По меньшей мере восемь белков, секретируемых микобактериями туберкулеза при культвировании был выделены и охарактеризованы в различной степени [85].
Все микобактериальные антигены являются углеводсодержащими соединениями. Как уже сообщалось, известно несколько типов углеводсодержащих антигенов микобактерий: 1) гликолипиды – липополисахариды (диацилтрегалоза), липоолигосахариды (липоарабиноманнан В-LAM-B), 2) фосфатидилинозитол маннозиды (РІМ); 3) гликопептидолипиды, скомпонованные из гликозилированного липопептида – «ядра» и «жирового хвоста», связанного с треонином белка.
Гликопротеины являются одними из важных углеводсодержащих соединений микобактерий. Большинство из них тесно ассоциировано с пептидогликановыми комплексами, состоящими из глюкозамина, мурамовой и диаминопимеликовой кислот [39]. В их составе полностью отсутствуют арабиноза, галактоза и связывающий их миколиларабиногалактан [55].
Основными антигенами M. tuberculosis, связанными с клеточными стенками, являются белки с молекулярной массой 10, 19, 23, 28, 30, 40–50 и 65 кД. Антигены с такими же молекулярными массами характерны для культурального фильтрата M. tuberculosis: 32, 30, 24, 22, 19 и 12 кД и относятся к общим антигенам M. bovis и M. tuberculosis: Р32, МРВ59, МРВ64, МРВ70, 19 кД и 12 кД соответственно. Содержание углеводов в молекулах антигенов культурального фильтрата может быть весьма значительным. Для дуплетного антигена 55–60 кД содержание сахара составляет 34,6 % а для очищенной молекулы 38 кД – 25,7 %. Высокоспецифичные моноклональные антитела против антигена 38 кД распознавали как протеин ТВ-71, так и углеводную часть ТВ-72.
Большинство исследователей для получения высокоспецифических антигенов используют ультразвуковые дезинтеграты, которые качественно отличаются от культуральных микобактериальных фильтратов наличием углеводсодержащих, ассоциированных с клеточной стенкой белков, а также присутствием негликозилированных зрелых секреторных белков в культуральных фильтратах [76]. Адсорбция антигенов ультразвуковых дезинтегратов, в отличие от культуральных фильтратов микобактерий, приводит к дополнительному связыванию белков клеточной стенки микобактерий. Из ультразвуковых дезинтегратов M. tuberculosis была выделена фракция, содержащая в качестве основного компонента антиген 85 кД, который обладал иммуногенными свойствами на лабораторных животных. Полученная фракция обладает широкой перекрестной активностью по отношению ко многим поликлональным антисывороткам против разных видов микобактерий.
Ультразвуковые дезинтеграты использовались в качестве антигенов при разработке средств серодиагностики туберкулёза (РСК, РДСК, РНГА, РДП, РЭМА, ИФА). А. Н. Шаровым с соавт. [41] предложена реакция аглютинации РА, которая выявляет до 77,7 % инфицированных животных в разведении антигена 1:16.
Ученые из Беларуси [22] также считают перспективным использование ультразвуковых дезинтегратов клеток микобактерий для постановки ИФА при туберкулезе. Авторы отмечают, что внедрение серологических реакций сдерживается значительной перекрестной реактивностью антигенов M. bovis, M. tuberculosis и атипичных микобактерий. Исследователи изучали специфичность ППД-туберкулина, антигенов из клеточных стенок, ультразвукового дезинтеграта бактериальной массы, культурального фильтрата M. bovis и его фракций в ИФА и сделали вывод, что продукты лизиса микобактерий (культуральный фильтрат и туберкулин) в ИФА более специфичны, чем антигены клеточных стенок (ультразвуковой дезинтеграт, антиген из клеточных стенок). Также в ИФА использовался антиген с молекулярной массой 85 кД, в сравнении с аналогичными показателями для стандартного антигена ППД- и моноантигена анти-S4C1G4, а с протективной целью – Аг-10, 12, 24 кДа [2].
Нашими исследованиями был установлен белково-нуклеотидный состав нативных фильтратов культуры БЦЖ, фильтратов культур микобактерий туберкулеза бычьего вида (штамм Vallae) после термической обработки и суспензий культур микобактерий БЦЖ и Vallae, разбитых на ультразвуковом дезинтеграторе.
С этой целью на жидкой синтетической питательной среде выращивали культуру референтного штамма возбудителя туберкулеза бычьего вида Vallae и вакцинного штамма БЦЖ. Через 55–60 суток культивирования ёмкость с вакцинным штаммом БЦЖ и два с референтным штаммом Vallae подвергали термической обработке в автоклаве при температуре 132°С в течение 2 часов.
Культуральный фильтрат отделяли от бактериальной массы, пропуская его через стерилизующие пластины. Бактериальную массу разбивали на ультразвуковой установке «УЗДН» и после пропускания через СФ-фильтры использовали для исследований.
При хроматографии в нативном фильтрате культуры БЦЖ обнаружены лишь нуклеотиды преимущественно с молекулярной массой от 8000 до 48000 Да.
Наибольшая концентрация нуклеотидов – 17,0–21,0 мкг/см3 (табл. 2) обнаружена во фракциях 16–18 (рис. 10), что соответствует молекулярной массе 14000–30000 Да.
Молекулярную массу белковых и нуклеотидных частиц определяли по градуировочной прямой, данные которой изложены в табл. 3.
После термической обработки культур БЦЖ и Vallae при давлении 2·105 Па (2 атм.) в течение 2 часов (в результате экстрагирования термостабильных белково-пептидных частиц из бактериальных клеток) в фильтрате появляются белки с молекулярной массой 5000–48000 Да, основную часть которых (66 %) составляют белки с молекулярной массой 14000–23000 Да (рис. 8). Другой пик концентрации белка характерен для фракции с молекулярной массой 6500 Да, которая составляет 13,6 % от общего количества белка. Общая концентрация белка в фильтрате – 1,1 мг/см3.
Дата добавления: 2015-10-21; просмотров: 19 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая лекция | | | следующая лекция ==> |