Корд-фактор характерен также и для атипичных микобактерий, хотя его проявления менее выражены, чем у патогенных штаммов. Так, М. phlei, M. vacca и M. xenopi при культивировании образуют микроколонии в виде «кос» и «жгутов», но их ширина составляет 40 мкм, 2-5 мкм и 5 мкм соответственно.
В ряде литературных источников [21, 34, 69] констатируется, что образование жгутов при выращивании микобактерий, связанное с корд-фактором, является подтверждением патогенности бактерий. Однако исследованиями Brambilla C. и соавт., (2012), [51] проведенных с помощью сканирующей электронной микроскопии было показано образование жгутов с образованием истинных связок при выращивании микобактерий, не относящихся к туберкулезным: Mycobacterium brumae и Mycobacterium fallax.
Строение клеточной стенки микобактерий
Обобщая обширные литературные данные о клеточной стенке микобактерий можно констатировать, что она – самая сложная по сравнению с оболочкой клеток остальных прокариот. Так, если грамотрицательные бактерии имеют две мембраны, клеточная стенка микобактерий состоит из нескольких слоев, часть из которых содержит сахара и имеет относительно постоянный состав. Наружные слои состоят из липидов, в основном миколовых кислот и их производных и характеризуются вариабельностью химического состава. При классической электронной микроскопии эти слои, как правило, не видны (электроннопрорсвечиваемый слой, зона низкой плотности). Каркас клеточной стенки составляют пептидогликаны (электронноплотный слой) и связанные с ними арабиногалактаны (полисахаридная строма), к которым крепятся миколовые кислоты и их производные. Миколовые кислоты присутствуют в клеточной стенке также в виде сульфолипидов и корд-фактора. Кроме того, в состав клеточной стенки входит липоарабиноманнан (LAM), который крепится на плазматической мембране, пронизывает всю клеточную стенку и выходит на ее поверхность. Биологическая роль конечных фрагментов липоарабиноманнана, в основном его маннозных радикалов, состоит в подавлении активации Т-лимфоцитов и лейкоцитов крови, что приводи к нарушению иммунного ответа на микобактерии [36].
Было также установлено, что около 10–15% массы оболочек микобактерий составляют пептиды, не входящие в состав муреина, хотя ковалентно связаны с ним и могут быть разрушены протеолитическими ферментами.
У вирулентных микобактерий в оболочке содержится полиглутаминовая кислота, составляющая несколько процентов от массы оболочек. Оболочка микобактерий имеет толщину 20–40 мкм и состоит из 3 и более слоев, выявляемых на срезах бактерий. Распределение различных компонентов оболочки в этих слоях до конца не установлено, но поверхность клеток гидрофобна.
Существование внешней двухслойной мембраны микобактерий было постулировано уже давно, но с помощью электронной микроскопии ультратонких срезов этого нельзя было непосредственно наблюдать. B. Zuber и соавт. (2008) [61] использовали крио-электронную микроскопию с образованием стекловидного льда (CEMOVIS) для подробного ультраструктурного анализа трех видов бактерий подотряда Corynebacterineae, а именно, Mycobacterium bovis БЦЖ, Mycobacterium smegmatis и Corynebacterium glutamicum. При этом было установлено, что миколовые кислоты связаны с комплексом пептидогликаны-арабиногалактаны микобактерий нековалентны и имеют важное значение для формирования внешней мембраны. Кроме того, в зернистом слое и зоне низкой плотности проявляется периплазматическое пространство. На основании этих исследований авторы предлагают модель организации липидов в наружной мембране (рис. 5) и подчеркивают, что она должна служить ориентиром для будущих исследований, направленных на определение связи структуры клеточной оболочки микобактерий и ее функции.
Рис. 5. Модель–«молния» углеводородных цепей липидов клеточной стенки (в маштабе) микроорганизмов подотряда Corynebacterineae у – микобактерий (А) и коринебактерий (В). (Черный цвет –миколовые кислоты; темно-синий – фосфолипиды (16 - до 18-углерод-длинные цепи); темно-серый – комплекс пептидогликанов-арабиногалактанов, светло-голубой – гликопептидолипиды, светло-серый – порин, оранжевый – трегалозодимиколат, красный – трегалозомономиколат) [61].
Оболочка микобактерий обладает высокой биологической активностью, в т.ч. адъювантной. Miyauchi M, и соавт. (2011) [46] установили иммуностимулирующее и ададьювантное действие арабиномиколовых кислот, выделенных из клеточной стенки микобактерий BCG путем кислотного гидролиза. Было показано, что они содержат такие фракции как моно-арабинозы миколат, пента-арабинозы тетрамиколат и гекса-арабинозы тетрамиколат. Введение мышам арабиномиколовых кислот индуцировало фактор некроза опухоли (ФНО-α) на уровне, сравнимом с BCG, а также повышало реакцию гиперчувствительности замедленного типа на опухолевые клетки.
Широко известен и используется полный адъювант Фрейнда, состоящий из убитых клеток микобактерий (обычно БЦЖ), добавленных к неполному адъюванту. Последний представляет собой суспензию минерального масла в воде, содержащий антиген. Добавление клеток микобактерий значительно усиливает эффект адъюванта. Введение клеток БЦЖ в маслянной эмульсии придает животным неспецифическую устойчивость к инфекции, в т.ч. к заражению неродственными микобактериями. Этот эффект отчасти зависит от присутствия «корд-фактора». Подобной активностью не обладает ни одна биологическая субстанция.
В последнее время установлено, что клетки микобактерий туберкулёза, их фрагменты и компоненты, в т.ч. «корд-фактор», обладают антиопухолевой активностью, что связано частично с цитотоксичностью, проявляющейся на уровне митохондрий.
В то же время остается до конца не выясненным вопрос о устойчивости микобактерий к высоким температурам, сопряженный с проблемой безопасности применения туберкулина. Так, В. В Власенко (1998)) [9] и А.П. Лысенко и соавт. (2007) [13] учитывая результаты изучения термической устойчивости возбудителя туберкулеза путем посева на авторскую питательную среду ВКГ автоклавированных препаратов и туберкулинов, а также исследовании свойств полученных культур микобактерий приходят к следующим выводам:
– автоклавирование при 120 С инактивирует патогенные формы возбудителя туберкулеза, но не предотвращает образование жизнеспособных защитных форм микобактерий типа спор;
– инкубирование автоклавированных препаратов возбудителя туберкулеза в симуляторе роста ВКГ и посев на питательную среду ВКГ обеспечивают прорастание адаптивных форм, имеющих общие антигены и участки ДНК с бактериальной формой возбудителя;
– изоляты, выделенные из образцов туберкулинов способны персистировать в организме морских свинок и в ряде случаев вызывать ГЧЗТ к туберкулину и частично восстанавливать кислотоустойчивость.
Однако возможность восстановления патогенности этими адаптивными формами возбудителя туберкулеза установлена не была.
Оценивая публикации об особенностях устойчивости возбудителей туберкулеза к антимикобактериальным факторам физической и химической природы приходим к выводу, что каждая научная статья вносит свою лепту в познание до сего времени таких «непознанных» биологических свойств как сохранение вида в постоянно меняющейся биологической и абиотической среде. Среди них экспериментальные работы вышеназванных авторов о термической устойчивости микобактерий, по нашему мнению, относятся к побуждающим активизацию фундаментальных исследований по проблеме туберкулеза человека и животных.
Появление этих и предыдущих публикаций вышеназванных авторов о воссоздании живых M. bovis после автоклавирования при 120 С в течении 30 мин., а также туберкулинов различных производителей вызвало всплеск дискуссий, подобно тем, которые были в конце XIX–начале ХХ столетий после сообщений в 1891 году Straus и Camelia о способности автоклавированных микобактерий вызывать у животных «некротуберкулез» и Cranher, Ledoux-Lebard (1901 г.), – о способности высушенной культуры возбудителя туберкулеза сохранять жизнеспособность после пребывания в среде при температуре 100 С.
Далеко не научной критикой, при отсутствии дискуссии и теоретических доводов, в свое время было встречено сообщение Г.М. Бошьяна (1949) о возможности выращивания микобактерий на питательной среде после посева туберкулина [6].
Большинство не согласных с данными этих авторов высказывали свое мнение, как правило, кулуарно, обходя научные и «печатные» трибуны. Среди тех, кто вступил в публичную дискуссию с авторами ХХI века, был профессор, академик Национальной академии аграрных наук Украины Бусол В.А. в статье «Суд над туберкулином» [8] привел доводы не столько о неспособности M. bovis расти после автоклавирования, сколько о невозможности сохранять такое свойство как вирулентность, а также другие видовые свойства возбудителя инфекции.
В публикациях отсутствовали теоретические доказательства способности болезнетворных микобактерий сохранять вид, а также генотипичные и фенотипичные свойства после воздействия температур выше 100 С0, что может быть связано с отсутствием исследований в этом направлении на молекулярном уровне. В преддверии выхода названных публикаций бытовала еще классическая биология, в которой, как утверждает А. Хорст (1982), преобладали абстрактные представления о «жизненных» процессах. В молекулярной биологии понятие «жизненного» процесса в макро– и микроорганизме заменяется обычными физико-химическими представлениями. Это позволяет формировать новый методический подход при изучении проблем патогенеза болезней заразной и незаразной патологии и распознать развитие патологии в системной биологической цепочке: геном–клетка–организм. В связи с этим автор отмечает, что генетический код, репликация ДНК, процессы транскрипции и трансляции достаточно сложны и заключают в себе столько возможностей их нарушения и только постоянная аутокоррекция способна препятствовать этому. Что касается механизмов репарации нуклеиновых кислот, то они так же важны, как и механизмы репликации и трансляции. Поэтому понимание этих и других процессов изменения в структуре ДНК может существенно расширить наши знания о действии на микроорганизмы высоких температур [40].
Учитывая вышесказанное, для более глубокого понимания биологии M. bovis и механизмов его устойчивости к различным факторам, в т.ч. и высокотемпературным, необходимы новые методические подходы, базирующиеся на молекулярных механизмах, особенно изменчивости и устойчивости ДНК.
Особенности капсулы микобактерий
По данными литературы [69; 70; 73; 78] все микобактерии обладают очень своеобразной капсулой из молекул жирных кислот, структура и функция которых до конца не изучена. Эта оболочка позволяет микобактериям выдерживать весьма суровые условия окружающей среды и выживать внутри клеток иммунной системы человека и животных (макрофагов), где все другие микробы погибают, будучи растворены с помощью ферментов. Помимо этого, капсула микобактерий кислотооустойчива и не пропускает обычные антибиотики.
При исследовании с помощью электронного микроскопа динамики фагоцитоза микобактерий туберкулеза человека, крупного рогатого скота и других патогенных микобактерий было обнаружено формирование электрон-просвечиваемой зоны (electron transparent zone, ETZ) (рис. 6).
Рис. 6. Вид колонии микобактерий (срез) под электронным микроскопом (Mycobacterium bovis) с видимой капсулярной и электрон-просвечиваемой зоной (ETZ)
Многие авторы связывают наличие ETZ с резистентностью микобактерий к ферментам фагоцитов, что обуславливается архитектоникой клеточной стенки. В ранних исследованиях этого феномена высказывалось предположение, [78], что сульфатиды и полиглутаминовая кислота клеточной стенки микобактерий туберкулеза могут быть вовлечены в феномен торможения слияния между фагосомами и лизосомами. В то же время у М. leprae и М. lepraemurium, у которых такого торможения не наблюдалось, было установлено наличие широкой ETZ, которая состоит из мукоидов. Этот слой должен препятствовать диффузии лизосомальных ферментов внутрь фагосом. Поскольку ETZ не существует в микобактерии до фагоцитоза, была поставлена задача увидеть, когда и как она формируется внутри макрофагов. При сравнении динамики образования ETZ в М. leprae и М. aviun, которые оба содержат мукоиды, фагоцитированных макрофагами клеток костного мозга мыши, было установлено, что у М. aviun ETZ появились в пределах от 1 до 2 часов после фагоцитоза. Это напоминало образование своего рода «опухоли» тонкого электронного прозрачного слоя клеточной стенки бактерий, которая наблюдалась в участках, где внешний слой полисахарида начинал исчезать. После 3-х часов инкубации этот слой полностью отсутствовал и все бактерии были окутаны густой ETZ. В М. leprae ETZ также формируется в течение одного часа после поглощения макрофагом.
Было также выявлено, что ETZ формируется также быстро в макрофагах, инфицированных инактивированными клетками M. avium или М. leprae Это показывает, что для образования такой зоны не требуется активного участия бактерий. ETZ значительно уменьшает распространение лизосомальных ферментов на бактерии у обоих видов, причем в М. leprae это оказалось особенно выраженным, поскольку, несмотря на присутствие кислой фосфатазы во многих фагосомах, ни количество бактерий в макрофагах, ни состояние их деградации не изменялись в течение 3,5 месяцев культивирования макрофагов [78].
При проведении количественной оценки частоты проявлення ETZ в разное время после заражения макрофагов бактериями из гладких и прозрачных (smooth transparent (SmT)) колоний M. аvium наблюдается более выраженная прозрачная зона и большее количество неповрежденных бактерий, чем при фагоцитировании бактерий из гладких куполообразных и непрозрачных (smooth domed-opaque (SmD)). При инфицировании макрофагов инактивированными УФ- или гамма-лучами, H2O2, теплом или глутаральдегидом ETZ была обнаружена у около 50% МБТ, тогда как для живых бактерий этот показатель составил 80-85% В отличие от живых бактерий, для которых процент частоты ETZ оставался стабильными на протяжении инкубационного периода, частота проявления ETZ для убитых бактерий снизилась с течением времени. При проведении сравнительной оценки проявления ETZ на микобактерииях туберкулеза штамма H37 Rv установлено, что несмотря на очень низкую частоту проявления ETZ (8-15%), доля интактных бактерий была идентична уровню с M. аvium, в отличие от трех быстро растущих непатогенных видов (M. smegmatis, М. phlei и М. fallax), которые характеризовались низкой частотой появления ETZ после фагоцитоза и быстрой деградацией. [69]
Необходимо отметить, что значительный массив исследований относительно капсулы микобактерий был проведен на возбудителе проказы – M. leprae – отдаленной родственницей палочки Коха, а установленные данные о структуре ее капсулы совпадают с таковыми у микобактерий туберкулеза.
В исследованиях M. E. Klegermanи соавт. (1996) [70] клеточная стенка микобактерий была визуализирована методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) тонких срезов. Было установлено наличие внутреннего плотного слоя, который авторы связывают с пептидогликанами, также электронно-прозрачного арабиногалактанмиколатного слоя и электронно-плотного наружного слоя. ПЭM тонких срезов M. bovis БЦЖ, подштамма Tice, показало наличие бислоя, каждый из которых имеет ширину 2-4 нм. Ширина промежуточного электронно-прозрачного слоя варьировала от 1 до 250 нм, и представляет собой аморфную оболочку, которая состоит из водорастворимых нейтральных α-глюканов, которые составляют около 12% сухого веса клетки.
Применение к микобактериям новых микроскопических методов позволило увидеть толстую оболочку в образцах стерильных культур. Также было продемонстрировано, что обширная ETZ сходна с ETZ внутри фагосом и видна вокруг in vitro выращенных культур M. tuberculosis и M. avium, в отличие от непатогенных видов (M. smegmatis и M. aurum). Так, Paul T.R и Beveridge T. J. (1994) [74] с использованием техники замораживания-замещения исследовали архитектуру клеточной стенки медленно растущих микобактерий, M. kansasii, при росте в пробирке и установили, что большинство бактерий имело окружающее их электронно-полупрозрачное пространство или электронно-прозрачные зоны [ETZ], окружающих большинство клеток, как описано в более ранней работе Yamamoto T. и соавт. (1958) [84].
При этом было выявлено по крайней мере два морфотипа микобактерий. Клетки первого имели относительно тонкий ETZ (11 ± 2,3 до 3,5 ± 3,1 нм), равномерно окружающий неизмененные клетки, содержащаяся в них цитоплазма заполнена хорошо окрашенными рибосомами, и ДНК-нуклеоиды распределены по всей клетке. Второй морфотип состоял из незначительного числа микроорганизмов, которые имели искаженную форму и были окружены гораздо более толстым (от 59 ±2,6 до 198±2,5 нм) ETZ в области клетки, которая, казалось, была втянута из места, которую она первоначально занимала [73]
Авторы также подтверждают липидную природу ETZ – исходя из того, что клетки были лишены ETZ после обработки нейтральными растворителями липидов (ацетон или этанол). Кроме того, при тонкослойной хроматографии полученных этанольных и ацетонных экстрактов был определен липидный компонент, который соответствовал конкретным фенольным гликолипидам М. kansasii. Полученные данные свидетельсьвуют, что метод замораживания-замещения в электронной микроскопии – надежный способ сохранения и индикации липидных полимеров, содержащихся в клеточной стенке микобактерий.
В противовес этому методу, при обработке клеток обычным способом для электронного микроскопирования, просвечивающий внешний слой сплющивается из-за обезвоживания и виден только тёмный верхний слой, отделённый от пептидогликанового электрон-просвечиваемым слоем. Этот артефакт объясняет, почему описание капсул микобактерий до не пор ограничено наличием плазматической мембраны и клеточной стенки. Техника замораживающего замещения исключает сокращение гидратированных структур, которые обычно образуются во время приготовления материала для электронного микроскопа, что минимизирует процесс экстракции растворимых липидов с помощью сочетания ультраскоростного замораживания и мягкой химической фиксации. Применение такого метода усиливает химические связи и стабилизирует клеточные структуры, что проявляется в более точном изображении морфологии микобактериальной капсулы. Некоторые микобактерии, обработанные таким путём, показывают обширное просвечивание наружного слоя, в котором виден слабо окрашенный тонкий слой [59]
В более поздних исследованиях, как указывает Brennan PJ (2003) [53] только применение ядерного магнитного резонанса, масс-спектрального анализа и определение генома микобактерий туберкулеза привели к глубокому пониманию не только структуры клеточной стенки микобактерий, но и основ их генетики и биосинтеза. По его представлению, архитектуру клеточной стенки составляет массивное «ядро», которое состоит из пептидогликана ковалентно связаного через линкер блока (L-Rha-D-GlcNAc-П) с линейным галактофураном, который в свою очередь, прикреплен к ряду сильно разветвленных нитей арабинофурана, которые в свою очередь прикреплены к миколиновым кислотам. Миколиновые кислоты ориентированы перпендикулярно к плоскости мембраны и обеспечивают действительно специальный липидный барьер, ответственный за многие физиологические и патогенные свойства микобактерий туберкулеза. Внедренными внутрь этой липидной среды являются липиды, которые интересовали исследователей на протяжении пяти десятилетий: корд-фактор, димиколилтрегалоза, сульфолипиды, фосфатидилинозитолы маннозидов и т.д. Также имеются данные о том, что миколиновые кислоты признаются CD1-ограниченными Т-клетками, что антиген 85, один из самых мощных защитных антигенов микобактерий туберкулеза, является миколилтрансферазой и липоарабиноманнан (LAM), взаимодействуя с короткими маннозоолигосахаридами, участвует в фагоцитозе микобактерий туберкулеза. В настоящее время исследования направлены на определение роли миколиновых кислот в "сигнализации" заражения, в патогенезе, а также в иммунном ответе, иногда по частям, а иногда и в организованном порядке.
Выявлению путей биосинтеза всех этих «экзотических» молекул (миколиновых кислот, микоцеростатов, LAM и полипренилфосфатов) способствует определение генома микобактерий туберкулеза. Например, известно, что синтез всего ядра будет инициироваться на декапрениле-P с синтезом линкерной единицы, что сопровождается наращиванием галактановых и арабинановых цепочек, пока этот интермедиат транспортируется через цитоплазматические мембраны. Последними шагами в этих событиях является прикрепление миколовых кислот и связывание пептидогликана [53].
Srinivasan V., и соавт (2012) [81] с помощью просвечивающей электронной микроскопии, исследовали участие трех слоев клеточной стенки (наружного гликопептидолипидного (ОL), среднего (ETL), содержащего арабиногалактан-миколовую кислоту и внутреннего – пептидогликанового (PGL) в формировании перегородки роста и сужения при делении быстрорастущих видов сапрофитных микобактерий (М. smegmatis) и медленно растущих видов патогенных микобактерий (М. xenopi и М.tuberculosis). Ими было установлено, что у M. smegmatis и M. xenopi при полном перегораживании сначала происходит свежий синтез PGL перегородки (S-PGL) и ETL перегородки (S-ETL) из PGL (E-PGL). Слои S-ETL и ETL (E-ETL) несоприкасаются между собой в связи с наличием E-PGL между ними. E-PGL исчезает, и S-ETL соединяется с E-ETL, когда GPL начинает расти и инвагинировать в S-ETL.
В тоже время у M. tuberculosis, S-PGL и S-ETL растут от E-PGL и E-ETL, соответственно, без разделения между E-ETL и S-ETL по E-PGL. Последующий рост и инвагинация GPL в S-ETL из раздела перегородки инициирует и завершает сужение перегородки. На рис. 7 представлена модель последовательного формирования полного микобактериального перегораживания, предложенная исходя из полученных результатов исследования, при котором формирование полной перегородки сопровождается ее сужением.
Авторы делают вывод, что защита места разделения перегородки наружным слоем до завершения процесса может придать эволюционное преимущество микобактериям. Это, вероятно, связано с двумя условиями. Во-первых, в отличие от E. coli и В.subtilis, которые растут и делятся примерно 20 минут, микобактерии растут медленно – М. xenopi делится один раз в 24 часа, микобактерия туберкулеза – один раз в 18 часов в естественных условиях, М. leprae делится один раз в 13,5 дней. Даже у так называемого "быстрорастущего" вида как М. smegmatis одно деление занимает около 3 часов. Во-вторых, патогенным видам, таким, как М. xenopi, M. ulcerans, М. leprae и M. tuberculosis, непатогенным экологическим видам, таким, как М. smegmatis, необходимы определенные потенции для формирования поляризации дочерних клеток, чтобы выжить в неблагоприятных условиях, в организме хозяина или в окружающей среде. Таким образом, покрытие области перегораживания наружным слоем и удерживание двух дочерних клеток друг с другом родительскими слоями клеточной оболочки, возможно, дает необходимые силы формирующимся полярным регионам дочерних клеток и защищает их от неблагоприятных условий окружающей среды в течение длительного периода перегораживания и деления клетки.
Рис. 7. Модель для формирования перегородки разделов и сужение в М. smegmatis и М. xenopi, и микобактерии туберкулеза.
(А- С) М. smegmatis и М. xenopi. (A) S-ETL и S-PGL растет, соединяясь с E-PGL, которая отделяет S-ETL от E-ETL. (B) – завершение формирования перегородки раздела созданными S-ETL и S-PGL. Показано продолжающееся наличие E-PGL, которое отделяет S-ETL от E-ETL.ОL начинает расти и инвагинировать в S-ETL для формирования сужения. (C) Прогрессирование роста и инвагинации OL в S-ETL. (D - G) – M. tuberculosis. (D) S-ETL и S-PGL растут непрерывно с E-ETL и E-PGL, соответственно. В отличие от процесса в М. smegmatis и М. xenopi, E-PGL между S-ETL и E-ETL нет. (F) Завершение формирования перегородки раздела. (G) OL начинает расти и инвагинировать в S-ETL для формирования сужения бактериальной клетки [81].
Культуральные, биохимические и генетические исследования микобактерий
Как уже указывалось, изменения при туберкулёзе характеризуются образованием в органах и тканях гранулем (туберкул). При послеубойной диагностике туберкулёза у млекопитающих подвергают осмотру заглоточные, подчелюстные, бронхиальные, средостенные, брыжеечные, надвыменные лимфатические узлы, лёгкие, печень, селезенку, молочную железу, плевру, брюшину, кишечник и другие органы и ткани, а у птиц печень, селезенку, лёгкие, трубчатую кость.
При заражении крупного рогатого скота микобактериями туберкулёза человеческого и птичьего видов классические патологоанатомические изменения характерные для туберкулезной инфекции обнаруживают редко.
Для бактериологического исследования в лабораторию направляют от млекопитающих – заглоточные, подчелюстные, бронхиальные, средостенные лимфатические узлы и кусочки органов со сходными с туберкулезоподобными изменениями. Пробы для гистологического исследования фиксируют 10% раствором формальдегида, а для бактериологического консервируют 30% раствором глицерина. Пробы хранят в лаборатории до окончания исследований.
Кусочки органов и тканей, отмытые от консервирующей жидкости, промывают в стерильной дистиллированной водой или физиологическим раствором, измельчают, растирают в ступке со стерильным песком или стеклом и заливают 5–10% раствором серной или щавелевой кислоты в соотношении 1:4 на 10–30 минут. Затем кислоту удаляют, гомогенная масса промывается в течение 5–10 минут физиологическим раствором и используется для приготовления мазков и посева на питательные среды.
Существенным фактором, повышающим частоту обнаружения микобактерий, являются культуральные методы с учетом сохранения жизнеспособности микобактерий. Для подавления роста неспецифической микрофлоры помимо серной кислоты и едкого натрия изучается возможность использования катионо- и анионоактивных детергентов – лауросепта, хлоргексидинглюконикума, трехзамещенного фосфата натрия. В наших исследованиях хорошие результаты получены при обработке патматериала 3–5% лимонной кислотой с 3–5% перекисью водорода и последующей нейтрализации аммиаком. Применение лимонной кислоты обеспечивает щадящее действие на микобактерии, а после нейтрализации ее аммиаком образуется питательный субстрат для разных видов возбудителя туберкулёза.
В исследованиях, проведенных Corner L.A., и соавт., (2011) [58] в качестве средств деконтаминации посторонней микрофлоры были использованs 2% гидроксид натрия (NaOH), 0,75% и 0,075% гексадецилпиридиния хлорид и 0,5% бензалкония хлорид (в конечной концентрации). В тоже время авторы делают вывод об определенном токсическом влиянии вышеперечисленных деконтаминантов на M.bovis, поскольку при проведении этой процедуры увеличилось минимальное время инкубации, необходимое для обнаружения положительных культур по сравнению с обработкой стерильной дистиллированной водой.
Рост микобактерий туберкулёза бычьего вида чаще обнаруживают через 20–60 дней, человеческого – на 20–30 день и птичьего – на 10–20 день, а атипичных микобактерий в разные сроки.
Микобактерии туберкулёза всех трех видов не образуют пигмента и растут на яичных средах без салицилата натрия: бычьего и человеческого вида – при 37–38°С, птичьего – 37–38°C и 45°С.
Атипичные микобактерии могут давать пигментированные и непигментированные колонии, расти при разных температурах и на простых средах. Атипичные микобактерии первой группы по классификации Райнона в нашей стране редко встречаются.
Биологические исследования (биопроба) применяют для обнаружения возбудителя болезни и определения его видовой принадлежности. Для биопробы используют морских свинок, кроликов и кур. Этот метод дает положительные результаты у морских свинок при наличии в инъецируемом материале 5–10 микобактерий туберкулёза. Биопробы от патматериала млекопитающих проводят на двух морских свинках, а от птиц – на 2 курах. Для определения вида возбудителя туберкулёза заражают двух морских свинок и двух кроликов, а если необходимо, то и двух кур. Биопробу проводят на животных и курах не реагирующих на туберкулин.
Суспензию патматериала вводят подкожно морским свинкам в области паха в дозе 1–2 мл, курам – в подкрыльцовую вену. Через 30–40 дней морских свинок и кур исследуют туберкулиновой пробой.
Принадлежность возбудителя туберкулёза к тому или иному виду определяют по следующим данным:
- при генерализованном туберкулёзе у морских свинок и кроликов – бычий вид;
- при отсутствии поражений или наличии единичных типичных очагов в лёгких у кроликов и генерализованного процесса у морских свинок – человеческий вид;
- при наличии поражений у кур и септического процесса у кроликов – птичий вид.
Очень важным биохимическим тестом при дифференциации и типировании микобактерий человеческого и бычьего видов является нитратредуктазная проба (рис. 8).
| |||
M.bovis | M.africanum | M.microti | BCG M. tuberculosis |
Рис. 8. Тест нитратредуктазный NO3 + 2H+ + 2e- NO2 + H2O
Для выращивания микобактерий туберкулёза используют такие классические яичные среды (рис. 9) Петраньяни, Гельберга и Левенштейна – Йенсена. Для приготовления питательных сред используют только свежие куриные яйца, цельное молоко, очищенный мелко нарезанный картофель, 7,5 мл двухпроцентного раствора малахитовой зелени на 300 мл среды.
Дата добавления: 2015-10-21; просмотров: 17 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая лекция | | | следующая лекция ==> |
