Перекисная резистентность эритроцитов у неиммунизированных животных была ниже (р≤0,05), чем у морских свинок опытной группы, иммунизированных изучаемым препаратом, и составила 17,6 %.
В плазме крови животных третьей группы концентрация См оказалась выше на 107 %, ЦИК – на 91 %, активность АсАТ – на 108 % по сравнению с соответствующими показателями у животных четвертой группы, а содержание мочевины оказалось ниже на 46 % (р≤0,05). Отмечена также тенденция к снижению концентрации альбумина.
Через три месяца после заражения у животных контрольной группы установлено достоверное снижение в 1,3 раза концентрации гемоглобина в эритроцитах, в 1,4 раза – альбумина и в 1,7 раза – активности аланинаминотрансферазы в плазме крови в сравнении с интактными животными (р≤0,01) (табл. 20).
Таблица 20. Гематологические и биохимические показатели крови морских свинок
Показатели | Группы | |||
1 | 2 | 3 | 4 | |
Эритроциты, | 7,4±0,25 | 8,23±0,5 | 7,46±0,3 | 8,66±1,1 |
Гемоглобин, г/л | 105±6,9* | 112±5,0* | 89,7±5,0 | 121,0±5,5* |
Альбумин, г/л | 41,4±2,1* | 44,4±3,9* | 34,3±3,4 | 49,4±8,0* |
АлАТ, ммоль/л·ч | 2,3±0,23 | 2,02±0,3 | 1,7±0,6 | 2,9±0,8* |
АсАТ, ммоль/л·ч | 1,0±0,12* | 1,3±0,2 | 1,67±0,3 | 1,8±0,4 |
Мочевина, | 1,8±0,16* | 1,8±0,26* | 1,07±0,1 | 1,7±0,09* |
ЦИК, г/л | 0,16±0,002* | 0,18±0,02* | 0,1±0,01 | 0,2±0,03* |
Серомукоиды, | 0,055±0,008* | 0,048±0,01* | 2,9±0,2 | 0,09±0,015* |
Примечание: «*» – разница достоверна по отношению к
контролю (р≤0,05).
Полученные данные указывают на снижение синтезирующей функции печени, что по всей видимости связано с поражением этого органа при развитии туберкулезного процесса при экспериментальном заражении.
У зараженных животных наблюдали также развитие иммуносупресивного состояния: концентрация серомукоидов выросла в 32 раза, а концентрация ЦИК была в 2 раза ниже относительно этих показателей у интактных животных.
Биохимические исследования крови иммунизированных животных дали возможность установить, что препарат ПКП-3 и вакцина БЦЖ сдерживают развитие патобиохимических изменений в организме животных.
Концентрация альбумина и активность АлАТ снижались у животных первой группы только в 1,2 раза, а у животных второй группы – в 1,2 раза и 1,3 раза соответственно, в сравнении с показателями интактных морских свинок.
Введение препаратов способствовало также снижению иммуносупресии в организме зараженных морских свинок: уровень серомукоидов был выше в 1,25–1,1 раза, а концентрация ЦИК даже повышалась в сравнении с показателями у животных четвертой группы.
Другие биохимические показатели крови иммунизированных и в дальнейшем инфицированных животных также существенно не отличались от таковых у интактных животных.
Патологоанатомическими исследованиями морских свинок, иммунизированных противотуберкулезным комплексным препаратом ПКП-3 и в последующем зараженных возбудителем туберкулеза бычьего вида (штамм Vallae), выявлено, что только у трёх животных развивались туберкулезоподобные изменения в лимфатических узлах регионарных месту введения возбудителя туберкулеза, тогда как у иммунизированных вакциной БЦЖ поражения внутренних паренхиматозных органов средней степени по классификации А. И. Тогуновой, туберкулёзом обнаружены у двух животных, слабой – у четырёх особей (табл. 3.5.3).
Гистологическими исследованиями установлено, что в селезенке и лимфатических узлах проявлений иммунной активации не выявлено. Фолликулы в большинстве случаев невелики, без выраженных реактивных центров герменативных зон. В некоторых случаях отмечено усиление трабекулярной стромы, что может быть проявлением ослабления ее функции.
Следует также отметить, что в отдельных лимфатических узлах трех морских свинок, которые имели туберкулезоподобные патологоанатомические изменения при вскрытии, наблюдали мелкие очаги из макрофагов с большим ядром и зоной эозинофильной цитоплазмы (похожих на эпителиальные клетки), которые объединяются в многоядерные симпласты, представляющие собой атипичные многоядерные гигантские клетки. Возможно эти изменения были обусловлены действием микобактериальных антигенов.
Очагов с характерными признаками, свойственных туберкулезным поражениям, не обнаружено.
При изучении гистоморфологического материала паренхиматозных органов у значительной части морских свинок второй группы, которые имели макроскопические поражения паренхиматозных органов и лимфатических узлов, в региональных месту заражения лимфатических узлах выявлены свойственные для туберкулезной инфекции поражения, которые вытесняли полностью ткани органов.
В отдаленных от места введения возбудителя туберкулеза лимфатических узлах трех морских свинок, которые имели туберкулезные макроскопические изменения, найдены зародыши туберкулезных очагов из разрозненных клеток и групп многоядерных клеток без замещения или разрушения ткани органа.
В печени одной морской свинки выявлены характерные продуктивные туберкулезные очаги с вакуолизацией и частично лизированными центрами размером до 1500 мкм, а у других отмечены туберкулезные поражения в виде очагов размером до 1000–1200 мкм в селезенке.
В легких морских свинок этой группы выявлены утолщения межальвеолярных перегородок разной степени, особенно выраженные у трех морских свинок, имеющих макроскопические изменения. В селезенке одной из них найдены очаги из 8 гигантских клеток. Состояние иммунных структур лимфатических узлов у разных морских свинок было неоднотипным. В лимфатических узлах двух морских свинок выявлены большие фолликулы с реактивными центрами, заполненными клетками.
В печени одной морской свинки выявлены характерные продуктивные туберкулезные очаги с вакуолизацией и частично лизированными центрами размером до 1500 мкм, а у других отмечены туберкулезные поражения в виде очагов размером до 1000–1200 мкм в селезенке.
В легких морских свинок этой группы выявлены утолщения межальвеолярных перегородок разной степени, особенно выраженные у трех морских свинок, имеющих макроскопические изменения (рис. 3.5.8). В селезенке одной из них найдены очаги из 8 гигантских клеток (рис. 3.5.9). Состояние иммунных структур лимфатических узлов у разных морских свинок было неоднотипным. В лимфатических узлах двух морских свинок выявлены большие фолликулы с реактивными центрами, заполненными клетками (рис. 3.5.10). Фолликулы с пустотами в местах, где были найдены участки с иммунологической деструкцией макрофагов были выявлены в лимфатических узлах и селезенке морских свинок со значительными макроскопическими туберкулезными поражениями паренхиматозных органов.
У животных контрольной группы наблюдали множественные туберкулезные очаги в лимфатических узлах, печени, селезенке, сливающиеся в скопления отторгнутых клеток.
С помощью бактериологических исследований не выявлено роста культуры возбудителя туберкулеза бычьего вида при высевах с патологоанатомического материала на питательную среду Левенштейна-Иенсена от морских свинок первой группы, которых иммунизировали противотуберкулезным комплексным препаратом ПКП-3, а в последующем заражали возбудителем туберкулеза бычьего вида.
Рост колоний культуры возбудителя туберкулеза проявился через 90 суток при посевах с патологоанатомического материала от двенадцати животных, иммунизированных вакциной БЦЖ, а от всех животных контрольной группы – на тридцатые сутки.
Таким образом, можно сделать вывод о том, что противотуберкулезный комплексный препарат ПКП-3 не вызывает у морских свинок патологоанатомических и гистологических изменений во внутренних органах, характерных для туберкулезной инфекции, т. е. препарат безвреден.
После введения препарата в месте введения образуются незначительные припухлости, которые постепенно рассасываются.
После введения препарата аллергические реакции на ППД-туберкулин сохраняются на протяжении двух месяцев у 21 % животных, что свидетельствует о низких аллергенных свойствах препарата по сравнению с вакциной БЦЖ.
Иммунизация морских свинок предлагаемым препаратом ПКП-3 препятствует развитию патологоанатомических, гистологических и патобиохимических изменений, свойственных инфекционному процессу при экспериментальном туберкулезе.
Введение препарата ПКП-3 восприимчивым животным способствует выработке иммунологической напряженности, которая обеспечивает надежную защиту животных от внедрения и размножения возбудителя туберкулеза бычьего вида (штамм Vallae).
Испытание безвредности, аллергенных и биологических свойств противотуберкулезного препарата ПКП-3 на бычках
Опыт проводили в благополучном по туберкулезу опытном хозяйстве Национального аграрного университета «Великоснитынское» (Киевская область) на 36 бычках 2–6-месячного возраста, не реагирующих на ППД-туберкулин.
Бычков распределяли на 2 группы: опытную – 26 голов и контрольную – 10 голов.
Животным опытной группы вводили препарат ПКП-3 двукратно с интервалом 14 суток, подкожно, компонент № 1 в дозе – 5,0 см3 с правой, а компонент № 2 – 1,0 см3 с левой стороны ниже средней линии шеи.
Животным контрольной группы вводили стерильный физиологический раствор в дозе 5,0 см3, подкожно в область нижней трети шеи.
На протяжении опыта наблюдали за клиническим состоянием опытных животных.
Для проведения гематологических и биохимических исследований отбирали кровь от опытных и контрольных животных до введения препарата и через 7, 19, 30, 45 и 60 суток после начала опыта.
Аллергические исследования проводили с помощью ППД-туберкулина Курской биологической фабрики серия № 39, контроль № 38, пригодного для использования до 2001 г., через 15, 30, 45, 60, 90 суток после применения препарата. В конце опыта животные опытной и контрольной группы были подвергнуты диагностическому убою с проведением патологоанатомических и бактериологических исследований.
При наблюдении за животными установлено, что через 24 часа после введения препарата в местах инъекций образовались припухлости объемом с куриное яйцо, плотной консистенции, теплые. Температура тела у всех опытных животных повышалась до 40,0±0,2°С и держалась на протяжении 48 часов, у 5 животных – 72 часа, у 4 – 96 часов и ещё у 4 – 120 часов, а затем приходила в норму.
Наличие температурной реакции на введение препарата характерно для всех препаратов, содержащих в своем составе продукты жизнедеятельности микроорганизмов, а наличие припухлости присуще всем гидроокисьалюминиевым вакцинным препаратам [9].
В дальнейшем опухоли в местах введения препарата постепенно рассасывались и через месяц после повторного введения препарата оставались лишь твердые припухлости величиной с горошину.
При проведении аллергических исследований установлено, что реакции на ППД-туберкулин появились через 15 суток после введения препарата во всех животных и сохранялись на протяжении месяца. В дальнейшем реакций на туберкулин не выявляли. Контрольные животные не реагировали на туберкулин и имели температуру тела в пределах физиологической нормы на протяжении опыта.
Наличие кратковременного аллергического воздействия препарата объясняется наличием в его составе корпускулярных микобактериальных частиц [15].
Исследованиями крови установлено, что препарат обладает незначительными антиоксидантными свойствами на что указывают показатели изменения концентрации ДК и МДА. Так, через 7 суток после введения препарата концентрация ДК – промежуточных продуктов ПОЛ, снижалась на 37 %, а МДА – на 66 %, (р≤0,05) (табл. 21 и 22, соответственно). На 19 сутки опыта отмечено незначительное возрастание интенсивности ПОЛ, хотя разница с контрольными показателями статистически достоверна. Снижение интенсивности ПОЛ в сыворотке крови наблюдалось до 45 суток опыта, когда уровень МДА был ниже от контрольных показателей на 37,5 %.
Таблица 21. Динамика изменения содержания диеновых коньюгатов в крови подопытных бычков
Группа животных | Концентрация диеновых конъюгатов, мМоль/дм3 | |||||
До введения препарата | После введения препарата, сутки | |||||
Опытная | 6,5±0,04 | 4,1±0,01* | 4,4±0,03* | 5,8±0,06 | 5,9±0,07 | 5,4±0,08 |
Контрольная | 5,6±0,02 | 6,5±0,8 | 6,2±0,08 | 5,9±0,07 | 5,6±0,09 | 5,3±0,06 |
Примечание: «*» – р≤0,05, разница достоверна по отношению к контролю.
Таблица 22. Динамика изменения содержания малонового диальдегида в крови подопытных бычков
Группа животных | Малоновый диальдегид, ΔD | |||||
До введения препарата | После введения препарата, сутки | |||||
Опытная | 1,1±0,01 | 0,45±0,01* | 0,52±0,05* | 0,56±0,06* | 0,9±0,04* | 1,0±0,08 |
Контрольная | 1,4±0,08 | 1,3±0,08 | 1,2±0,07 | 1,0±0,07 | 1,4±0,03 | 1,1±0,05 |
Примечание: «*» – р≤0,05, разница достоверна по отношению к контролю.
Наблюдаемое торможение процессов перекисного окисления липидов является по-видимому одной из причин повышения перекисной резистентности эритроцитов (ПРЭ) – интегрального показателя потенциальной устойчивости мембран клеток к действию перекисей (табл. 23) [50]. Учитывая данные литературы о том, что снижение ПРЭ указывает на уменьшение стойкости мембран этих клеток к действию перекисей, одной из причин этому может быть компенсаторное расходование пула структурных антиоксидантов, которое происходит в ответ на нарушение гомеостаза в организме при введении препарата [50].
Таблица 23. Динамика изменения перекисной резистентности эритроцитов в крови подопытных бычков
Группа животных | Гемолиз, % | |||||
До введения препарата | После введения препарата, суток | |||||
Опытная | 22,5±0,7 | 15,2±0,4* | 19,2±0,5* | 26,8±0,6 | 38,9±1,4 | 36,3±1,7 |
Контрольная | 24,2±1,1 | 23,0±0,8 | 26,8±0,9 | 24,6±0,7 | 34,7±1,1 | 38,1±1,3 |
Примечание: «*» – р≤0,05, разница достоверна по отношению к контролю.
На 7 и 19 сутки опыта гемолиз у животных опытной группы был достоверно ниже на 33 и 28 % соответственно.
Биологическое действие препарата ПКП-3 проявилось также в статистически достоверном повышении уровня общего белка в сыворотке крови опытных животных, которое продолжалось около 30 суток: с максимальным повышением на 21 % на 7 сутки по отношению к контролю (табл. 24).
Исходя из литературных данных [8] это связано с наработкой специфических антител к антигенам микобактерий, содержащихся в препарате.
Таблица 24. Динамика изменения содержания общего белка
в крови подопытных бычков
Группа животных | Общий белок, г/дм3 | |||||
До введения препарата | После введения препарата, суток | |||||
Опытная | 78,2±0,7 | 95,4±0,6* | 93,2±0,5* | 87,6±0,9* | 78,9±0,8 | 77,1±0,7* |
Контрольная | 76,6±0,5 | 78,3±0,7 | 84,5±0,9 | 74,2±3,9 | 82,4±2,7 | 80,1±0,9 |
С динамикой изменения общего белка коррелируют данные о концентрации ЦИК – комплексов Аг–Ат средних размеров. Известно, что ЦИК принимают участие в регуляции как хемотаксической способности, так и метаболической активации нейтрофилов. Cтатистически достоверное повышение уровня ЦИК у опытных животных проявилось на 7 сутки опыта на 47 % по сравнению с контролем, а максимальным был уровень этого показателя на 30 сутки, когда повышение составило 89 % (табл. 25).
Таблица 25. Динамика изменения содержания ЦИК в крови подопытных бычков
Группа животных | ЦИК, мг/см3 | |||||
До введения препарата | После введения препарата, суток | |||||
Опытная | 0,19±0,008 | 0,28±0,009* | 0,31±0,005* | 0,36±0,006* | 0,32±0,008* | 0,29±0,007 |
Контрольная | 0,18±0,008 | 0,19±0,008 | 0,17±0,009 | 0,19±0,004 | 0,18±0,008 | 0,21±0,006 |
За период исследования незначительно повышалось содержание лейкоцитов к 30–45 суткам опыта у бычков по сравнению с таковыми показателями у контрольных животных (табл. 26).
Отмечено уменьшение на 11 % концентрации эритроцитов в крови подопытных животных к 19 суткам после введения препарата, а показатели концентрации гемоглобина в крови у опытных и контрольных бычков достоверно не отличались.
Таблица 26. Динамика изменения содержания лейкоцитов в крови подопытных бычков
Группа животных | Лейкоциты, тыс./мкл | |||||
До введения препарата | После введения препарата, суток | |||||
Опытная | 4,6±0,01 | 4,8±0,02* | 5,2±0,02* | 5,8±0,06* | 5,9±0,04* | 5,3±0,08* |
Контрольная | 5,2±0,02 | 5,0±0,08 | 4,8±0,06 | 4,6±0,07 | 4,7±0,02 | 5,1±0,01 |
Примечание: «*» – р≤0,05, разница достоверна по отношению к контролю.
Повышение концентрации серомукоидов на 44 % к 7 суткам опыта свидетельствует о первоначальном иммуносупресивном действии (табл. 27). препарата, а дальнейшее уменьшение этого показателя до исходных величин и уменьшение в 2,5 раза его концентрации говорит о стабилизации иммунной системы и значительном иммуностимулирующем действии со стороны изучаемого препарата
Таблица 27. Динамика изменения содержания серомукоидов в крови подопытных бычков
Группа животных | Концентрация серомукоидов, мг/см3 | |||||
До введения препарата | После введения препарата, сутки | |||||
Опытная | 0,8±0,03 | 1,2±0,07* | 0,9±0,01 | 0,8±0,02 | 0,9±0,04* | 0,7±0,06 |
Контрольная | 0,7±0,02 | 0,6±0,04 | 0,8±0,06 | 0,7±0,04 | 0,7±0,08 | 0,8±0,03 |
Примечание: «*» – р≤0,05, разница достоверна по отношению к контролю.
При проведении патологоанатомических исследований в месте введения препарата и во внутренних органах изменений свойственных туберкулезной инфекции не обнаружено. Бактериологическими исследованиями микобактерий возбудителя туберкулеза не выявлено.
На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что препарат ПКП-3:
— не вызывает у крупного рогатого скота патологоанатомических изменений характерных для туберкулезной инфекции;
— через 24 часа после введения препарата в местах инъекций образуются припухлости объемом с куриное яйцо, плотной консистенции, теплые. Температура тела у животных повышается до 40,0±0,2°С и держится на протяжении 48–120 часов. Образующиеся припухлости в местах введения препарата рассасываются в течение месяца до размера горошины;
— аллергические реакции на ППД-туберкулин появляются через 15 суток после введения препарата во всех животных и сохраняются на протяжении месяца;
— препарат обладает незначительными антиоксидантными свойствами на что указывают показатели изменения концентрации ДК и МДА;
— торможение процессов перекисного окисления липидов является причиной повышения перекисной резистентности эритроцитов (ПРЭ) – интегрального показателя потенциальной устойчивости мембран клеток к действию перекисей;
— индуцирует повышение уровня общего белка, концентрации ЦИК (комплексов Аг–Ат), содержания лейкоцитов и уменьшение в 2,5 раза концентрации серомукоидов, что свидетельствует о значительном иммуностимулирующем действии со стороны изучаемого препарата.
Изучение иммуногенных и протективных свойств препарата ПКП-3 на крупном рогатом скоте
Разработанный и апробированный на высоковосприимчивой лабораторной модели (морских свинках) противотуберкулезный молекулярно-субъединичный комплексный препарат ПКП-3, был подвергнут испытаниям по изучению его иммуногенных и протективных свойств на крупном рогатом скоте в условиях неблагополучного по туберкулезной инфекции хозяйства.
Для проведения этих исследований были взяты животные ЗАО «Єдність» Магдалиновского района Днепропетровской области, неблагополучного по туберкулезу крупного рогатого скота с 1996 г.
За 1996 г. выделено 17 коров, реагирующих на туберкулин из 926 голов (450 коров) общего поголовья крупного рогатого скота, а при диагностическом убое реагирующих – у 2 коров выявлены туберкулезные поражения лимфатических узлов (средостенных, бронхиальных). На следующий год было выявлено уже 265 (117 коров), из них у шести – выявлены патологоанатомические изменения, присущие туберкулёзной инфекции.
В 1998 г. было выявлено 110 голов (91 корова) при общем поголовье животных в хозяйстве – 568 голов (300 коров). При убое реагирующих у 8 из них обнаружены поражения туберкулёзного характера. Поголовье животных в 1999 г. уменьшилось до 292 голов (156 коров). Аллергическими исследованиями всего поголовья выделено 39 голов (28 коров) крупного рогатого скота, среди которых при диагностическом убое у 18 голов выявлены туберкулезные поражения.
Во время весенней туберкулинизации 2000 г. всего поголовья животных (200 голов), выявлено 12 реагирующих на туберкулин животных, а при их убое – у 9 выявлены классические поражения туберкулёзного характера лёгочных лимфоцитов.
В опыт брали все поголовье крупного рогатого скота, насчитывающее 113 голов из них 76 голов коров, 22 – телки до 6 месяцев возраста, 14 –бычков до 2 лет и 1 бык-производитель. Животные были разбиты на 4 группы. В три из них были отобраны животные, которые до начала опыта не реагировали на туберкулин: 2 опытные (68 и 14 голов) и 1 контрольную (17 голов). Животным этих групп вводили:
1 группа (n=68)– препарат ПКП-3 в дозе компонент № 1 – 5,0 см3 и компонент № 2 – 1,0 см3, подкожно, ниже средней линии шеи с левой и правой стороны, двукратно с интервалом 14 суток;
2 группа (n=14) – вакцину БЦЖ Ставропольской биологической фабрики в дозе 1,0 см3, подкожно ниже средней линии шеи, двукратно с интервалом 14 суток.
3 группа (контрольная n=17) – стерильный физиологический раствор, подкожно в дозе 5,0 см3.
В 4 группу были отобраны животные (14 голов), которые до начала опыта реагировали на ППД-туберкулин (больные). Животным этой группы ничего не вводили.
После иммунизации животные всех групп были размещены в одном помещении при беспривязном содержании.
С целью установления выделяемости микобактерий туберкулеза из экскретов больных животных двукратно отбирались пробы молока, бронхиальной слизи и крови для проведения бактериологических исследований.
Пробы крови отбирали до начала опыта и через 1, 1,5, 3, 4, 8, 10 месяца после иммунизации от животных всех групп для проведения гематологических и биохимических исследований.
Аллергические исследования проводили до начала опыта и через 1, 1,5, 3, 3,5, 7 и 8 месяцев после иммунизации с использованием ППД-туберкулина для млекопитающих с последующим диагностическим убоем реагирующего скота из опытных и контрольных групп через 2 (24 головы), 3 (30 голов), 6 и 8 (49 голов), 12 (3 головы) месяцев с проведением патологоанатомических и бактериологических исследований.
В результате проведенных исследований установлено, что из полученных образцов бронхиальной слизи, крови и молока при посеве на среду Левенштейна-Иенсена не получено культуры микобактерий туберкулеза, а при постановке биологической пробы с этими образцами погибли от туберкулеза через 3 месяца после заражения молоком, полученным от 11 (91 %) из 12 больных животных (табл. 28). При введении молока, крови и бронхиальной слизи от нереагирующих животных (условно здоровых) морским свинкам гибели животных и поражений туберкулезного характера при вскрытии не обнаружено.
Таблица 28. Результаты биологической пробы на морских свинках материалом, полученным от больных туберкулезом животных
№ п/п | Инвентарный номер | Результаты биологической пробы | ||
Бронхиальной слизью | Кровью | Молоком | ||
1. | 5359 тощая | — | — | + |
2. | — | — | + | |
3. | — | — | + | |
4. | — | — | + | |
5. | — | — | + | |
6. | — | — | + | |
7. | — | — | + | |
8. | — | — | + | |
9. | — | — | + | |
10. | — | — | + | |
11. | — | — | — | |
12. | — | — | + | |
13. | 5317 условно здоровая | контроль — | — | — |
14. | 5339 условно здоровая | контроль — | — | — |
15. | 5345 условно здоровая | контроль — | — | — |
Аллергическими исследованиями установлено, что через месяц после иммунизации в обеих опытных группах реагировали все животные, а уже через 45 суток в первой реагировало 51 %, второй – 100 %, контрольной – 55 % животных. Через три месяца после иммунизации в первой группе реагировало 29 % крупного рогатого скота (табл. 29). Через 3,5 месяца после иммунизации реагировало на туберкулин в первой группе 7 %, а через 7 месяцев – 4 % особей.
Дата добавления: 2015-10-21; просмотров: 22 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая лекция | | | следующая лекция ==> |