Длительность наблюдения за лягушками - 15 мин., если испытывают лекарственное растительное сырье и лекарственные препараты наперстянки, ландыша, горицвета; для лекарственных препаратов строфанта, желтушника - 20 мин. Если в течение этого времени отчетливой остановки сердца не произошло, наблюдение продолжают еще 5 мин. Лягушек, у которых сердце начинает вновь сокращаться ранее, чем через 5 мин. после остановки, в расчет не принимают.
Вычисляют содержание ЛЕД в 1 мл, 1 г или в 1 таблетке испытуемого образца по формулам, приведенным для подкожного введения, но значения A и B зависят от принципа расчета доз, т.е. от вида применяемых лягушек:
A - наименьшая доза (в мл на массу травяной лягушки или в мл на 1 г массы водяной лягушки), установленная для раствора ИП;
B - наименьшая доза (в мл на массу травяной лягушки или в мл на 1 г массы водяной лягушки), установленная для раствора стандартного образца.
3. Метод испытания при введении в вену. У лягушек проводят поперечный разрез кожи на уровне ключиц, затем по средней линии живота до симфиза, где надсекают кожу вправо и влево. Образовавшиеся лоскуты кожи отводят в стороны. На внутренней поверхности после отведения в сторону лоскутов кожи с каждой стороны видна большая кожная вена в виде петли, идущей по поверхности прямой мышцы живота от кожи спины книзу, а затем снова вверх, где она впадает в верхнюю полую вену. Затем выводят наружу сердце аналогично методу испытания при введении под кожу. Доску с группой препарированных животных поворачивают так, чтобы головы лягушек были обращены к экспериментатору для удобства введения иглы в нисходящее колено петли вены лягушки.
При введении лягушкам внутривенным способом растворов cтандартных образцов и ИП в соответствующем разведении, освобожденных от избытка спирта и летучих веществ, рассчитывают вводимую дозу на 1 г массы тела (табл. 30.1).
Лягушкам, относящимся к одной группе (5 штук), вводят в вену одинаковые дозы раствора cтандартного образца или ИП тонкой иглой, соединенной со шприцем вместимостью 1 мл, со скоростью 0,1 мл за 5 с. После каждого введения накладывают кровоостанавливающие зажимы, которые не снимают до конца опыта. Время наблюдения за остановкой сердца лягушки - 15 мин., если испытывают лекарственное растительное сырье и лекарственные препараты наперстянки, ландыша, горицвета; для лекарственных препаратов строфанта, желтушника - 20 мин. Если в течение этого времени отчетливой остановки сердца не произошло, наблюдение продолжают еще 5 мин.; о результатах судят по изменениям, наступающим в дополнительное время.
Определение наименьшей дозы стандартного образца и ИП, вызывающей систолическую остановку сердца у большинства лягушек (не менее 3) из 5, проводят так же, как при введении под кожу. Допустимое отклонение между вводимыми дозами должно быть не более 0,0005 мл на 1 г массы лягушки.
Наименьшими дозами обычно являются 0,004-0,006 мл раствора на 1 г массы лягушки.
Вычисляют содержание ЛЕД в 1 мл, 1 г или в 1 таблетке ИП по формулам, приведенным для подкожного введения, но с другими обозначениями A и B:
A - наименьшая доза (в мл на 1 г массы лягушки), установленная для раствора ИП;
B - наименьшая доза (в мл на 1 г массы лягушки), установленная для раствора cтандартного образца.
2. МЕТОД БИОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ СЕРДЕЧНЫХ ГЛИКОЗИДОВ
НА КОШКАХ
Отбор кошек и их содержание
Для опыта отбирают кошек обоего пола, здоровых, не беременных и не лактирующих, массой 2,0-3,5 кг, находившихся в условиях лабораторного содержания в течение 2-3 сут. За 16-20 ч до начала опыта животных лишают пищи, но не воды.
Техника испытания и принцип расчета
Опыт проводят под легким наркозом (например, 200-250 мг/кг гексенала в мышцу бедра). В отпрепарированную бедренную вену животного вводят канюлю, соединенную тонкой каучуковой трубкой, с градуированной бюреткой вместимостью 50-100 мл, откуда поступает раствор ИП, приготовленный на 0,9% растворе натрия хлорида для инъекций. На пути между бюреткой и канюлей включают стеклянный змеевик, помещенный на водяную баню с температурой 39 град. C для поддержания постоянной температуры (37 град. C) вводимого раствора. В резиновую трубку, соединяющую стеклянный змеевик с канюлей, вставляют с помощью стеклянного тройника термометр, показывающий температуру жидкости, поступающей к животному. Жидкость из бюретки вытекает под постоянным давлением, что достигается введением в бюретку стеклянного капилляра внешним диаметром не более 1 мм, укрепленного при помощи каучуковой пробки в верхнем отверстии бюретки (по принципу сосуда Мариотта). Длина капилляра должна быть такова, чтобы его нижний конец доходил до уровня нижнего деления бюретки. Скорость вытекания жидкости из бюретки регулируют при помощи зажима, наложенного на каучуковую трубку, или стеклянного крана таким образом, чтобы в вену животного в 1 мин. поступал 1 мл испытуемого раствора. Можно использовать другое оборудование, позволяющее соблюдать указанную скорость введения и температуру испытуемого раствора. Введение раствора проводят до наступления остановки сердца. Длительность опыта должна составлять не менее 30 и не более 55 мин. Момент остановки сердца определяют по исчезновению сердечного толчка и контролируют последующим вскрытием грудной клетки. При наличии патологических изменений в органах опыт в расчет не принимают.
Оценку активности ИП можно проводить двумя способами:
1) по сравнению со стандартным образцом;
2) в кошачьих единицах действия (КЕД).
1. Оценка активности ИП по сравнению со стандартным образцом.
В опыт берут не менее 12 кошек: по 6 животных, как для стандартного образца, так и для ИП. Данные, полученные при биологическом испытании стандартного образца, могут быть использованы для расчетов в последующих опытах в течение 15 сут. без повторного испытания.
Результаты опыта обрабатывают согласно подразделу "Обработка результатов определения биологической активности сердечных гликозидов на кошках" общей фармакопейной статьи "Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний".
Результаты опытов удовлетворяют требованиям метода, если отношение
_
стандартного отклонения среднего результата S_ к средней смертельной дозе y
y
не превышает 5,7%. В противном случае необходимо увеличить число опытов.
ИП считают прошедшим испытание, если отношение средних смертельных доз
ИП и стандартного образца составляет 90-110%, а их разность не превышает
величины S x t.
d
2. Определение активности ИП в КЕД. Для выражения активности ИП в кошачьих единицах действия (КЕД) расчет проводят для каждого животного по формуле:
K x m
A = ------,
a
где: K - разведение ИП;
m - масса животного в килограммах;
a - доза разведенного ИП в миллилитрах.
Из данных, полученных в опытах, выводят среднее число КЕД и вычисляют (в КЕД и процентах) отклонения результатов отдельных опытов от среднего числа КЕД.
Результаты опытов удовлетворяют требованиям метода, если найденное среднее отклонение от среднего числа КЕД будет меньше максимально допустимого отклонения для данного числа опытов, указанного в табл. 30.2.
Таблица 30.2
Максимально допустимое отклонение отдельных опытов
от среднего значения
Число опытов | Отклонение, % | Число опытов | Отклонение, % |
9,4 | 16,3 | ||
11,5 | 17,6 | ||
13,3 | 18,9 | ||
14,9 | 20,0 |
Из табл. 30.2 следует, что испытания можно проводить на 3 кошках (минимальное число опытов), но только в том случае, если полученное в опытах отклонение будет меньше 9,4%. В противном случае, число опытов следует увеличить.
Таблица 30.3
Пример расчета: определение числа КЕД для
раствора строфантина K 0,05% для инъекций
N | Масса | Разведение раствора | Доза, | Число | Отклонение от | |
КЕД | % | |||||
1. | 2,63 | 1:50 | 3,55 | +0,22 | +6,6 | |
2. | 2,56 | 1:50 | 3,28 | -0,05 | -1,5 | |
3. | 2,22 | 1:50 | 3,17 | -0,16 | -4,8 |
Среднее число КЕД = 3,33
31. СТЕРИЛЬНОСТЬ (ОФС 42-0066-07)
Лекарственные средства для инъекций и инфузий, глазные капли, мази, пленки и другие препараты и субстанции, в отношении которых имеются соответствующие указания в документации, должны быть стерильными, то есть не содержать микроорганизмов.
Методы контроля стерильности применяют для испытания всех лекарственных средств независимо от их природы и лекарственной формы.
1. Условия проведения испытания
Испытание на стерильность проводят в асептических условиях, чтобы избежать микробной контаминации во время посева, используя, например, ламинар-бокс класса А, расположенный в зоне класса В, или изолятор. Можно применять и другие меры, предотвращающие контаминацию, при условии, что они не оказывают пагубное влияние на микроорганизмы, которые могут содержаться в исследуемых образцах. Условия проведения испытания регулярно контролируют в соответствии с правилами GMP.
2. Определение антимикробного действия
До проведения испытания на стерильность следует определить, обладает ли исследуемый образец антимикробным действием, которое может существенно повлиять на результаты испытания.
Для этого готовят взвеси культур тест-микроорганизмов (табл. 31.4) с конечной концентрацией не более 100 колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл. Испытание проводят дважды с каждым микроорганизмом в отдельности.
В пробирки с 10 мл питательной среды, рекомендованной для испытания, вносят по 1 мл приготовленной взвеси тест-микроорганизма.
В две пробирки с инокулированной средой вносят по 1 мл исследуемого образца, в две другие вносят по 1 мл соответствующего растворителя - положительный контроль. Посевы на тиогликолевой среде инкубируют при температуре (32,5 +/- 2,5) град. C в течение 3-х сут. Посевы на жидкой соево-казеиновой среде и среде Сабуро инкубируют при температуре (22,5 +/- 2,5) град. C в течение 5 сут.
Сравнивают рост тест-микроорганизмов в контрольных и опытных посевах при визуальном просмотре. Если результаты неодинаковые, то есть, в контроле наблюдают рост тест-микроорганизма, а в опыте рост отсутствует, считают, что исследуемый образец обладает бактериостатическим или фунгистатическим действием.
2.1. Устранение антимикробного действия
При наличии антимикробного действия исследуемого образца используют специфические инактиваторы, указанные в нормативных документах. Например, парааминобензойная кислота для сульфаниламидов, бета-лактамаза для пенициллинов и цефалоспоринов.
Неспецифические инактиваторы (твин-20, твин-80, яичный лецитин, гистидина гидрохлорид, натрия тиосульфат и другие) добавляют в буферный раствор и (или) в питательные среды, как правило, до стерилизации.
Для разведения исследуемого образца перед испытанием на стерильность можно использовать нейтрализующую жидкость, приготовленную в лаборатории или промышленного производства, следующего состава:
Полисорбата-80 (твина-80) - 30,0 г
Лецитина яичного (или соевого) - 3,0 г
L-гистидина гидрохлорида - 1,0 г
Пептона (мясного или казеинового) - 1,0 г
Натрия хлорида - 4,3 г
Калия фосфата однозамещенного - 3,6 г
Натрия фосфата двузамещенного - 7,2 г
Воды - 1000 мл
Стерилизуют в автоклаве, валидируя процесс стерилизации.
pH после стерилизации 7,0 +/- 0,2.
Если разведение в вышеприведенном растворе не устраняет антимикробное действие исследуемого образца, то увеличивают концентрацию твина-80 или лецитина. Альтернативно допускается добавление в буферный раствор специфических инактиваторов, устраняющих антимикробное действие лекарственных средств или консервантов (табл. 31.1).
Таблица 31.1
Инактиваторы антимикробного действия консервантов
Тип консерванта | Инактиватор | Концентрация в |
Фенолы | Натрия лаурилсульфат | 4 г/л |
Органо-ртутные | Натрия тиогликолят | 0,5-5 г/л |
Галогены | Натрия тиосульфат | 5 г/л |
Четвертичные | Яичный желток | 5-50 мл/л |
При отсутствии инактиватора исследуемый образец разводят, изменяя соотношение объемов посевного материала и питательной среды, или используют метод мембранной фильтрации.
3. Испытание на стерильность
3.1. Отбор образцов для анализа
Для испытания отбирают образцы лекарственного средства в количестве, указанном в табл. 31.2, если нет других указаний в частной фармакопейной статье.
Таблица 31.2
Количество единиц (ампул, флаконов и др.) от серии
исследуемого образца для проведения анализа
┌───────────────────────────────────┬─────────────────────────────────────┐
│ Количество единиц в серии │ Количество единиц │
│ │ для проведения анализа (не менее) │
├───────────────────────────────────┼─────────────────────────────────────┤
│ 1 │ 2 │
├───────────────────────────────────┼─────────────────────────────────────┤
│Парентеральные лекарственные │ │
│средства: │ │
│- Не более 100 │10% или 4 (берут наибольшее) │
│- От 100 до 500 │10 │
│- Более 500 │2% или 20 (берут наименьшее) │
│- Парентеральные лекарственные │2% или 10 (берут наименьшее) │
│средства большого объема │ │
│- Антибиотики, твердые формы - │6 │
│ангро (более 5 г) │ │
├───────────────────────────────────┼─────────────────────────────────────┤
│Неинъекционные лекарственные │ │
│средства (в том числе глазные): │ │
│- Не более 200 │5% или 2 (берут наибольшее) │
│- Более 200 │10 │
│- Препараты в однодозовой упаковке │См. графу "Парентеральные │
│ │лекарственные средства" │
├───────────────────────────────────┼─────────────────────────────────────┤
│Твердые формы, ангро: │ │
│- Не более 4 упаковок │Каждую │
│- Свыше 4, но не более 50 │20% или 4 (берут наибольшее) │
│- Свыше 50 │2% или 10 (берут наибольшее) │
└───────────────────────────────────┴─────────────────────────────────────┘
При вскрытии образцов не допускают их контаминации микроорганизмами, которые могут находиться на его внешней поверхности. Ампулы и пробки флаконов протирают спиртом этиловым ректификованным 96% и фламбируют.
3.2. Для посева на каждую питательную среду используют количество исследуемого образца, приведенное в табл. 31.3, если нет других указаний в частной фармакопейной статье.
Таблица 31.3
Минимальное количество образца для посева на
питательные среды
┌─────────────────────────────────────┬───────────────────────────────────┐
│Количество лекарственного средства в │ Количество образца для посева │
│ упаковке │ │
├─────────────────────────────────────┼───────────────────────────────────┤
│Жидкие │ │
│- Менее 1 мл │Весь объем │
│- 1-40 мл │1/2 г содержимого, но не менее 1 мл│
│- 40-100 мл │20 мл │
│- более 100 мл │10% содержимого, но не более 20 мл │
│- Антибиотики │1 мл │
│- Другие препараты, растворимые в │Содержимое упаковки, │
│воде или изопропилмиристате │но не менее 0,2 г │
├─────────────────────────────────────┼───────────────────────────────────┤
│Нерастворимые препараты, мази и │Содержимое упаковки, │
│кремы, поддающиеся эмульгированию или│но не менее 0,2 г │
│суспендированию │ │
├─────────────────────────────────────┼───────────────────────────────────┤
│Твердые │ │
│- Менее 0,05 г │Все содержимое │
│- 0,05-0,3 г │1/2 г содержимого, но не более │
│ │0,05 г │
│- 0,3-5 г │0,150 г │
│- более 5 г │0,500 г │
└─────────────────────────────────────┴───────────────────────────────────┘
3.3. Метод мембранной фильтрации
При определении стерильности лекарственных средств, обладающих выраженным антимикробным действием, и лекарственных средств в сосудах вместимостью более 100 мл, используют метод мембранной фильтрации. Исключение составляют лекарственные средства с антимикробным действием, нерастворимые в воде или изопропилмиристате.
Испытание проводят с использованием фильтрационной установки, которая должна быть смонтирована таким образом, чтобы исследуемый раствор (жидкость) можно было ввести и профильтровать в условиях асептики. После окончания фильтрации мембрану асептически переносят в 100 мл питательной среды. Испытания проводят под вакуумом 93,3 кПа (70 см рт. ст.) при скорости вытекания воды 55-75 мл в 1 мин.
Допускается использование аппарата, представляющего собой стерильную замкнутую систему и работающего также по принципу фильтрации растворов, с мембраной, вмонтированной в канистру, в которую после фильтрования добавляют стерильную среду. Используют мембранные фильтры с размером пор 0,45 +/- 0,02 мкм и внешним диаметром 47 мм. Фильтры из нитрата целлюлозы используются для водных, масляных и слабых спиртовых растворов, фильтры из ацетата целлюлозы - для концентрированных спиртовых растворов и др. Гидрофобный край фильтра и низкая сорбционная способность сводят к минимуму потери препарата при фильтрации.
Для лекарственных средств, не обладающих бактериостатическим или фунгистатическим действием, можно использовать фильтры без гидрофобного края, увлажняя их перед фильтрацией, если нет других указаний в частной фармакопейной статье.
Установки и фильтры стерилизуют и хранят в условиях, гарантирующих сохранение стерильности.
При исследовании лекарственных средств в виде раствора в масле, фильтр и установка перед анализом должны быть тщательно высушены.
3.3.1. Пробоподготовка водных растворов
Лекарственное средство в упаковке перемешивают, отбирают необходимое для испытания количество исследуемого образца (табл. 31.3) и асептически переносят на один или несколько фильтров.
Мембранную фильтрацию проводят с помощью вакуума или давления. Фильтры асептически снимают с фильтродержателя и помещают в обе среды. При использовании замкнутой системы канистры заполняют равным объемом сред. При этом следует избегать аэрации тиогликолевой среды.
Если исследуемый образец обладает антимикробным действием или в его состав входит консервант, то для промывания фильтров используют раствор натрия хлорида изотонический 0,9% или жидкость N 1 (раздел 3.4.). Испытание проводят, исключая контаминацию микроорганизмами последней порции жидкости для промывания.
3.3.2. Пробоподготовка жидкостей, не смешивающихся с водой
Испытание проводят, как указано в разделе 3.3.1.
Перед помещением на фильтр вязких жидкостей или суспензий для увеличения скорости фильтрации к общей пробе асептически добавляют достаточное количество подходящего растворителя.
Если в состав исследуемого образца входят лецитин, масло или консервант и при наличии антимикробного действия, то для промывания фильтров используют жидкость N 2 (раздел 3.4.). Испытание проводят, исключая контаминацию микроорганизмами последней порции жидкости для промывания.
3.3.3. Пробоподготовка лекарственных средств, растворимых в изопропилмиристате (ИПМ)
Мази на жировой основе и эмульсии типа "вода в масле" растворяют в ИПМ, предварительно простерилизованном методом мембранной фильтрации с использованием мембран с диаметром пор 0,22 мкм. Стерильный растворитель и, если необходимо, исследуемый образец непосредственно перед фильтрацией нагревают до температуры не более 44 град. C.
Первоначально через мембрану пропускают стерильный ИПМ в количестве 5 мл. Затем фильтруют раствор препарата в ИПМ. Для максимальной эффективности процесса над фильтром постоянно должен быть слой раствора во время фильтрации. После фильтрации мембрану промывают вначале двумя порциями жидкости N 2, по 200 мл каждая, а затем 100 мл жидкости N 1.
При испытании в питательные среды добавляют твин-80 из расчета 1 г/л.
Если в состав лекарственного средства входит вазелин, для промывания фильтров используют жидкость N 3. Перед началом фильтрации через фильтр пропускают 200 мл жидкости N 3. Для максимальной эффективности процесса над фильтром постоянно должен быть слой раствора во время фильтрации. После фильтрации образца фильтр промывают тремя порциями жидкости N 3 (раздел 3.4.) по 100 мл каждая.
3.3.4. Пробоподготовка препаратов в шприц-тюбиках
Содержимое каждого шприц-тюбика переносят в две воронки установки для мембранной фильтрации или собирают общую пробу в стерильную пробирку для последующего переноса на фильтр.
3.3.5. Пробоподготовка твердых лекарственных форм для инъекций (кроме антибиотиков)
Готовят разведение в соответствии с инструкцией по применению. Испытание проводят в соответствии с разделами 3.3.1. и 3.3.2.
3.3.6. Пробоподготовка стерильных аэрозольных препаратов Содержимое препаратов в аэрозольной упаковке асептически извлекают и помещают в стерильную колбу нажатием на шток распылительного клапана. Если возможно, пропелент удаляют путем испарения. Добавляют в колбу жидкость N 2 и осторожно перемешивают.
Испытание проводят, как указано в разделах 3.3.1. и 3.3.2.
3.4. Жидкости для промывания мембранных фильтров при контроле лекарственных средств, обладающих антимикробным действием
Для промывания фильтров можно использовать любой растворитель, не подавляющий рост микроорганизмов:
- Раствор натрия хлорида изотонического 0,9% стерильного pH 7,0.
- Жидкость N 1:1 г ферментативного пептона растворяют в 1000 мл воды, фильтруют или центрифугируют для осветления, разливают в сосуды и стерилизуют.
pH после стерилизации - 7,1 +/- 0,2.
При фильтровании образцов пенициллинов или цефалоспоринов (если необходимо) к жидкости N 1 добавляют определенное количество бета-лактамазы, указанное в частной фармакопейной статье, достаточное для инактивации остаточного антимикробного действия антибиотика на фильтре.
- Жидкость N 2:1 мл твина-80 добавляют к 1000 мл жидкости N 1, разливают в сосуды и стерилизуют.
Дата добавления: 2015-09-29; просмотров: 23 | Нарушение авторских прав
| <== предыдущая лекция | | | следующая лекция ==> |